1. Comprensió inicial

En aquesta etapa, hem d'entendre alguns conceptes i terminologia, per tal d'evitar equivocar-nos davant les nostres persones grans, com ara:

P: Quina diferència hi ha entre RT-PCR, qPCR, PCR en temps real i RT-PCR en temps real?

Resposta: RT-PCR és PCR de transcripció inversa(PCR de transcripció inversa, RT-PCR), que és una variant àmpliament utilitzada de la reacció en cadena de la polimerasa (PCR).En RT-PCR, una cadena d'ARN es transcriu inversament a ADN complementari, que després s'utilitza com a plantilla per a l'amplificació d'ADN per PCR.
PCR en temps real i qPCR(Quantitative Rea-ltime-PCR) són el mateix, tots dos són PCR quantitativa en temps real, el que significa que cada cicle de PCR té registres de dades en temps real, de manera que el nombre de plantilles inicials es pot ajustar amb una anàlisi precisa.

Tot i que tant la PCR en temps real (PCR quantitativa fluorescent en temps real) com la PCR de transcripció inversa (PCR de transcripció inversa) semblen abreujar-se com a RT-PCR, la convenció internacional és: RT-PCR es refereix específicament a la transcripció inversa.PCR, la PCR en temps real s'abreuja generalment com a qPCR (PCR quantitativa en temps real).

I RT-PCR en temps real (RT-qPCR), és la PCR de transcripció inversa combinada amb la tecnologia quantitativa fluorescent: primer obteniu l'ADNc (RT) de la transcripció inversa de l'ARN i, a continuació, utilitzeu la PCR en temps real per a l'anàlisi quantitativa (qPCR).La majoria de laboratoris fan RT-qPCR, és a dir, investigacions sobre la regulació a la baixa de l'expressió d'ARN, de manera que la qPCR de la qual tothom parla al laboratori en realitat fa referència a RT-qPCR, però no oblideu que encara hi ha moltes proves d'ADN en aplicacions clíniques.Anàlisi quantitativa, com ara la detecció de VHB del virus de l'hepatitis B.

Pregunta: Després de llegir molta PCR quantitativa fluorescent, per què s'ha de controlar el fragment amplificat dins del rang de 80-300 pb?

Respon: La longitud de cada seqüència de gens és diferent, algunes són de diversos kb, algunes són de centenars de pb, però només necessitem que la longitud del producte sigui de 80-300 pb quan dissenyem primers, massa curts o massa llargs no són adequats per a la detecció quantitativa de PCR fluorescent.El fragment del producte és massa curt per distingir-se del dímer imprimador.La longitud del primer-dímer és d'uns 30-40 pb, i és difícil distingir si es tracta d'un primer-dímer o un producte si és inferior a 80 pb.Si el fragment del producte és massa llarg, supera els 300 pb, fàcilment conduirà a una baixa eficiència d'amplificació i no pot detectar eficaçment la quantitat del gen.

Per exemple, quan comptes quantes persones hi ha a una aula, només cal comptar quantes boques hi ha.El mateix passa quan detecteu gens, només cal detectar una determinada seqüència d'un gen per representar La seqüència sencera servirà.Si voleu comptar persones, heu de comptar tant la boca com el nas, les orelles i les ulleres, i és fàcil cometre errors.

Per ampliar, en investigació biològica, hi ha molts casos d'investigació d'un punt a un altre, perquè la seqüència gènica de qualsevol espècie és molt llarga, és innecessari i impossible mesurar tots els fragments, com la seqüenciació bacteriana 16S, que consisteix a dur a terme la seqüència conservadora d'assaigs de bacteris per inferir el nombre d'una determinada població de bacteris.

P: Quina és la longitud òptima per al disseny d'imprimació de qPCR?

Respon: En general, la longitud de la imprimació és d'uns 20-24 pb, que és millor.Per descomptat, hem de parar atenció al valor TM de l'imprimació a l'hora de dissenyar l'imprimació, perquè això està relacionat amb la temperatura òptima de recuit.Després de molts experiments, s'ha demostrat que 60 °C és un millor valor de TM.Si la temperatura de recuit és massa baixa, conduirà fàcilment a una amplificació inespecífica.Si la temperatura de recuit és massa alta, l'eficiència d'amplificació serà relativament baixa, el pic de la corba d'amplificació començarà més tard i el valor CT es retardarà.

P: En què és diferent el mètode del tint del mètode de la sonda?

Resposta: mètode de tintAlguns colorants fluorescents, com ara SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO, etc., no emeten llum per si mateixos, però emeten fluorescència després d'unir-se al solc menor de l'ADN de doble cadena.Per tant, al començament de la reacció de PCR, la màquina no pot detectar el senyal fluorescent.Quan la reacció arriba a l'etapa de recuit-extensió, s'obre la doble cadena i es sintetitza una nova cadena sota l'acció de l'ADN polimerasa, i la molècula fluorescent s'uneix al solc menor dsDNA.A mesura que augmenta el nombre de cicles de PCR, cada cop es combinen més colorants amb ADN de doble cadena i el senyal fluorescent també es millora contínuament.El mètode de tint s'utilitza principalment en la investigació científica.
PD: Aneu amb compte a l'hora de fer l'experiment, el colorant s'ha de combinar amb ADN humà, aneu amb compte de convertir-lo en una persona fluorescent.

Mètode de tint (esquerra) Mètode de sonda (dreta)
PD: Aneu amb compte a l'hora de fer l'experiment, el colorant s'ha de combinar amb ADN humà, aneu amb compte de convertir-lo en una persona fluorescent.

SYBR Green Ⅰ s'uneix al solc menor de l'ADN

Mètode de la sondaLa sonda Taqman és la sonda d'hidròlisi més utilitzada.Hi ha un grup fluorescent a l'extrem 5′ de la sonda, generalment FAM, i la sonda en si és una seqüència complementària del gen objectiu.Hi ha un grup d'extinció fluorescent a l'extrem 3′.D'acord amb el principi de transferència d'energia de ressonància de fluorescència (Förster resonance energy transfer, FRET), quan el grup fluorescent reporter (molècula fluorescent donant) i el grup fluorescent d'extinció (molècula fluorescent acceptadora) s'excita Quan els espectres es superposen i la distància és molt propera (7-10 nm), l'excitació de la molècula fluorescent accepta, mentre que la molècula fluorescent accepta l'autofluorescència. nce està debilitat.Per tant, al començament de la reacció de PCR, quan la sonda estigui lliure i intacta al sistema, el grup fluorescent informador no emetrà fluorescència.En recuit, l'imprimació i la sonda s'uneixen a la plantilla.Durant l'etapa d'extensió, la polimerasa sintetitza contínuament noves cadenes.L'ADN polimerasa té activitat exonucleasa 5′-3′.En arribar a la sonda, l'ADN polimerasa hidrolitzarà la sonda de la plantilla, separarà el grup fluorescent informador del grup fluorescent extintor i alliberarà el senyal fluorescent.Com que hi ha una relació un a un entre la sonda i la plantilla, el mètode de la sonda és superior al mètode del colorant pel que fa a la precisió i la sensibilitat de la prova.El mètode de la sonda s'utilitza principalment en el diagnòstic.

P: Què és la quantificació absoluta?Què és la quantificació relativa?

Respon: La quantificació absoluta es refereix al càlcul del número de còpia inicial de la mostra que s'ha de provar mitjançant qPCR, com ara quants virus del VHB hi ha en 1 ml de sang.El resultat obtingut per quantificació relativa és el canvi en la quantitat del gen objectiu en una mostra específica en relació amb una altra mostra de referència, i l'expressió gènica està regulada a l'alça o a la baixa.

P: La quantitat d'extracció d'ARN, l'eficiència de la transcripció inversa i l'eficiència d'amplificació afectaran els resultats experimentals?
P: L'emmagatzematge de mostres, els reactius d'extracció, els reactius de transcripció inversa i els consumibles de transmissió de llum afectaran els resultats experimentals?
P: Quin mètode pot corregir les dades experimentals?

Pel que fa a aquests problemes, els descriurem amb detall a les seccions avançades i avançades a continuació.
2. Coneixements avançats

Pel que fa a la PCR quantitativa fluorescent en temps real, hem de reconèixer la realitat que cada any es publiquen milers de treballs de recerca científica, entre els quals la tecnologia de PCR quantitativa fluorescent no és poca.

Si no hi ha cap estàndard comú per mesurar l'experiment de PCR quantitativa fluorescent, els resultats poden variar àmpliament.Per al mateix gen de la mateixa espècie, amb el mateix mètode de processament, els resultats de la detecció també variaran molt, i serà difícil que els retardats repeteixin els mateixos resultats.Tu Ningú sap què és correcte i què està malament.

Vol dir això que la PCR quantitativa fluorescent és una tecnologia trampa o una tecnologia poc fiable?No, és perquè la PCR quantitativa fluorescent és més sensible i més precisa, i una mica d'operació incorrecta produirà resultats completament oposats.Una petita pèrdua és a mil milles de distància.L'autor de l'article pot ser torturat repetidament pels revisors.Al mateix temps, els revisors de la revista també són difícils de triar entre diferents resultats experimentals.

Tot plegat, apuntant a una manca de consens en els experiments de PCR en temps real.Amb aquesta finalitat, científics sèniors de la indústria van començar a formular estàndards,exigir als col·laboradors que proporcionin alguns detalls experimentals i de processament de dades necessaris (incloses les dades necessàries) a l'article per complir aquests estàndards .

Els revisors poden jutjar la qualitat de l'experiment llegint aquests detalls;els futurs lectors també poden utilitzar-ho per repetir l'experiment o millorar-lo.Aleshores, els resultats experimentals obtinguts d'aquesta manera estan plens d'informació, d'alta qualitat i utilitzables.

MIBBI (Informació mínima per a investigacions biològiques i biomèdiques)http://www.mibbi.org) va néixer.MIBBI és un projecte que proporciona estàndards per a experiments.Es publica a la natura.Aquest projecte està dirigit a diversos experiments biològics, com ara biologia cel·lular, Microarray, qPCR que parlarem ara, etc., i preveu cada tipus d'experiment a l'hora d'enviar manuscrits.Aquesta informació s'ha de proporcionar en tot moment.

En el projecte MIBBI, hi ha dos articles relacionats amb la PCR quantitativa fluorescent, a saber:
·RDML (Real-Time PCR Data Markup Language): un llenguatge estructurat i una guia d'informes per a dades quantitatives de PCR en temps real;
·MIQE (Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments) – informació mínima per publicar articles sobre experiments quantitatius de PCR en temps real.
Primer, parlem de RDML, l'especificació terminològica.

Si no hi ha una definició estàndard per a tot, és impossible continuar la discussió, per això l'explicació dels termes és tan important a l'examen.
La terminologia utilitzada en l'experiment de PCR quantitativa fluorescent inclou el contingut següent.QIAGEN ens ha fet el millor resum.Els següents estan tots secsmercaderies .

Corba d'amplificació
La corba d'amplificació fa referència a la corba realitzada durant el procés de PCR, amb el número de cicle com a abscissa i la intensitat de fluorescència en temps real durant la reacció com a ordenada.

Una corba d'amplificació excel·lent hauria de tenir les característiques següents: la línia de base és plana o lleugerament disminuïda, i no hi ha cap tendència a l'alça evident;el punt d'inflexió de la corba és clar i el pendent de la fase exponencial és proporcional a l'eficiència d'amplificació.Com més gran sigui el pendent, més gran serà l'eficiència d'amplificació;la corba d'amplificació global El paral·lelisme és bo, indicant que l'eficiència d'amplificació de cada tub és similar;la fase exponencial de la corba d'amplificació de mostres de baixa concentració és òbvia.

Línia de base (línia de base)
La línia de base és el nivell de soroll del cicle inicial, normalment mesurat entre el 3r i el 15è cicle, perquè l'augment del valor de fluorescència provocat pel producte d'amplificació no es pot detectar durant aquest període.El nombre de cicles utilitzats per calcular la línia de base es pot variar i pot ser que s'hagi de reduir si s'utilitzen quantitats elevades de plantilla o si el nivell d'expressió del gen objectiu és alt.

L'establiment de la línia de base requereix visualitzar les dades de fluorescència de la corba d'amplificació de linealitat.La línia de base s'estableix de manera que el creixement de la corba d'amplificació comenci amb un número de cicle superior al número superior del cicle de la línia de base.Les línies de base s'han d'establir individualment per a cada seqüència objectiu.Els valors de fluorescència mitjans detectats en els primers cicles s'han de restar dels valors de fluorescència obtinguts en els productes amplificats.Les últimes versions de diversos programaris de PCR en temps real permeten l'optimització automàtica de la configuració de referència per a mostres individuals.

Durant els primers cicles de la reacció d'amplificació de la PCR, el senyal de fluorescència no canvia gaire.Aproximar-se a una línia recta s'anomena línia de base, però si ens fixem de prop els primers cicles, veiem que dins de la línia de base hi ha el que està passant a la imatge següent.

Fons a què es refereix el fons
el valor de fluorescència inespecífic de la reacció.Per exemple: extinció de fluorescència ineficient;o un gran nombre de plantilles d'ADN de doble cadena a causa de l'ús de SYBR Green.Els components de fons del senyal s'eliminen matemàticament mitjançant l'algoritme de programari de PCR en temps real.

Senyal del reporter
El senyal del reporter es refereix al senyal fluorescent generat per SYBR Green o sondes específiques de seqüència marcades amb fluorescència durant la PCR en temps real.

Senyal del reporter normalitzat (RN)
RN es refereix a la intensitat de fluorescència del colorant informador dividida per la intensitat de fluorescència del colorant de referència passiu mesurada a cada cicle.

Colorant de referència passiu
En alguns PCR en temps real,el colorant fluorescent ROX s'utilitza com a referència interna per normalitzar el senyal fluorescent.Corregeix les variacions degudes al pipeteig inexacte, a la posició del pou i a les fluctuacions de fluorescència per a pou.

El llindar de fluorescència (llindar)
es va ajustar per sobre del valor de fons i significativament per sota del valor de l'altiplà de la corba d'amplificació.Ha de situar-se a la regió lineal de la corba d'amplificació, que representa l'interval log-lineal de detecció de PCR.Els llindars s'han d'establir a la vista de la corba d'amplificació logarítmica de manera que la fase logarítmica lineal de la PCR sigui fàcilment identificable.Si hi ha diversos gens objectiu a la PCR en temps real, s'ha d'establir el llindar per a cada objectiu.Generalment, el senyal de fluorescència dels primers 15 cicles de reacció de PCR s'utilitza com a senyal de fons de fluorescència, i el llindar de fluorescència és 10 vegades la desviació estàndard del senyal de fluorescència dels primers 3 a 15 cicles de PCR, i el llindar de fluorescència s'estableix en la fase d'amplificació exponencial de la PCR.En general, cada instrument té el seu llindar de fluorescència establert abans del seu ús.

Llindar de cicle (CT) o punt d'encreuament (CP)
El cicle en què la corba d'amplificació creua el llindar (és a dir, el punt en què la detecció de fluorescència augmenta significativament).CT pot ser una fracció i es pot calcular la quantitat de plantilla inicial.El valor CT representa el nombre de cicles experimentats quan el senyal fluorescent de cada tub de reacció de PCR arriba al llindar establert.Hi ha una relació lineal entre el valor CT de cada plantilla i el logaritme del número de còpia inicial de la plantilla, elmés gran és el número de còpia inicial, menor és el valor CT i viceversa.Es pot fer una corba estàndard utilitzant un estàndard amb un número de còpia inicial conegut, on l'abscissa representa el valor CT i l'ordenada representa el logaritme del número de còpia inicial.Per tant, sempre que s'obtingui el valor CT de la mostra desconeguda, el número de còpia inicial de la mostra es pot calcular a partir de la corba estàndard.

Valor ΔCT
El valor ΔCT descriula diferència entre el gen objectiu i el valor CT del gen de referència endògen corresponent, com ara un gen de neteja, i s'utilitza per normalitzar la quantitat de plantilla utilitzada:
⇒ΔCT = CT (gen objectiu) – CT (gen de referència endògen)

Valor ΔΔCT
El valor ΔΔCT descriu la diferència entre el valor ΔΔCT mitjà d'una mostra d'interès (p. ex., cèl·lules estimulades) i el valor ΔΔCT mitjà d'una mostra de referència (p. ex., cèl·lules no estimulades).La mostra de referència també s'anomena mostra de calibratge i totes les altres mostres es normalitzen a aquesta per a la quantificació relativa:
⇒ΔΔCT = ΔCT mitjana (mostra d'interès) – ΔCT mitjana (mostra de referència)

Gens de referència endògens (gens de referència endògens)
Els nivells d'expressió dels gens de referència endògens, com ara els gens domèstics (gens domèstics), no difereixen entre les mostres.La comparació dels valors CT del gen de referència amb el gen objectiu permet que el nivell d'expressió del gen objectiu es normalitzi a la quantitat d'ARN d'entrada o ADNc (vegeu la secció sobre els valors de ΔCT anterior).

Gens de referència intern correctes perpossible degradació de l'ARN o la presència d'inhibidors enzimàtics a les mostres d'ARN, així com variacions en el contingut d'ARN, l'eficiència de la transcripció inversa, la recuperació d'àcids nucleics i la manipulació de mostres.Per seleccionar el gen(s) de referència òptim, vam modificar l'algorisme per permetre la selecció de la referència òptima depenent de la configuració experimental.

Control intern
Una seqüència de control que s'amplifica en la mateixa reacció que la seqüència diana i s'aplica amb una sonda diferent (és a dir, realitzant PCR dúplex).Sovint s'utilitzen controls interns per descartar amplificacions fallides, com ara quan no es detecta la seqüència objectiu.
Mostra de calibratge
Una mostra de referència (per exemple, ARN purificat d'una línia cel·lular o teixit) utilitzada en la quantificació relativa per comparar totes les altres mostres per determinar el nivell d'expressió relatiu d'un gen.La mostra de calibratge pot ser qualsevol mostra, però normalment és un control (per exemple, una mostra no tractada o una mostra del temps zero de l'experiment).

Controls positius
utilitzar reaccions de control ambquantitats conegudes de plantilla.Sovint s'utilitzen controls positius per comprovar que un conjunt d'imprimació o un conjunt d'encebadors-sonda funciona correctament i que la reacció està configurada correctament.

Sense control de plantilla (NTC)
Una reacció de control que conté tots els components necessaris de la reacció d'amplificació excepte la plantilla, que se sol substituir per aigua.L'ús de NTC pot trobar la contaminació causada per la contaminació del reactiu o l'ADN estrany, garantint així l'autenticitat i la fiabilitat de les dades de detecció.L'amplificació del control NTC indica contaminació.

Sense control RT (NRT)
El procés d'extracció d'ARN pot contenir ADN genòmic residual, que és extremadament nociu i és el culpable que afecta la qualitat de les dades i l'enemic natural de la qPCR, de manera que quan es dissenyen experiments, s'ha de dissenyar només per amplificar la detecció d'ARN.Hi ha dues maneres, una és dissenyar cebadors a través dels introns, l'altra és eliminar completament l'ADN, quina és la millor, que es comentarà més endavant.El control NTR és un mirall màgic per detectar la contaminació de l'ADN.Si hi ha amplificació, vol dir que hi ha contaminació.

Normes
Els estàndards són mostres de concentració coneguda o nombre de còpies que s'utilitzen per construir una corba estàndard.Per tal d'assegurar l'estabilitat de l'estàndard, el fragment del gen es clona normalment al plasmidi i s'utilitza com a estàndard.

La corba estàndard
generalment es dilueix en almenys 5 gradients de concentració amb el producte estàndard segons la relació de duplicació, i es dibuixen 5 punts en les coordenades del valor CT i el nombre de còpia, i els punts es connecten per formar una línia per generar una corba estàndard.Per a cada corba estàndard, cal comprovar-ne la validesa.El valor del pendent es troba entre –3,3 i –3,8, i cada concentració es realitza per triplicat.Els punts que siguin significativament diferents d'altres punts s'han de descartar.El valor CT de la mostra a provar es porta a la corba estàndard i es pot calcular el nivell d'expressió de la mostra a provar.

El valor CT de la mostra a provar es porta a la corba estàndard i es pot calcular el número de còpia inicial de la mostra a provar.

Eficiència i pendent
El pendent de la corba estàndard representa l'eficiència de la PCR en temps real.
·Un pendent de -3,322 indica que l'eficiència d'amplificació de la PCR és 1, o 100% eficient, i la quantitat de producte de PCR es duplica a cada cicle.
·Un pendent inferior a –3,322 (per exemple, –3,8) indica una eficiència de PCR
·Un pendent superior a –3,322 (per exemple, –3,0) indica que l'eficiència de la PCR sembla ser superior al 100%, la qual cosa és curiós, com podria un cicle de PCR generar més del doble del producte amplificat?Aquesta situació es produeix en la fase no lineal de la reacció de PCR, és a dir, hi ha una gran quantitat d'amplificació inespecífica.

corba de fusió
Un cop completada l'amplificació de la qPCR, el producte de la PCR s'escalfa.A mesura que augmenta la temperatura, el producte d'amplificació de doble cadena es fon gradualment, donant lloc a una disminució de la intensitat de la fluorescència.Quan s'arriba a una determinada temperatura (Tm), es fon un gran nombre de productes.La fluorescència baixa bruscament.Els diferents productes de PCR tenen diferents valors de Tm i diferents temperatures de fusió, de manera que es pot identificar l'especificitat de la PCR.

Corba de fusió (corba derivada)
La corba de fusió es deriva per formar un mapa de pics, que pot mostrar de manera més intuïtiva la situació dels fragments de producte de PCR.Com que la temperatura de fusió és el valor de Tm del fragment d'ADN, es poden jutjar alguns paràmetres que afecten el valor de Tm del fragment d'ADN, com ara la mida del fragment, el contingut de GC, etc. En termes generals, segons els nostres principis de disseny d'imprimació,la longitud del producte amplificat està en el rang de 80-300 pb, de manera que la temperatura de fusió hauria d'estar entre 80 °C i 90 °C.

Interpretació de la corba de fusió: Si l'únic pic principal apareix entre 80°C-90°C, vol dir que la PCR quantitativa fluorescent és perfecta;si el pic principal apareix entre els 80 °C-90 °C i els pics diversos apareixen per sota dels 80 °C, bàsicament es considera el dímer d'imprimació.Podeu intentar augmentar la temperatura de recuit per resoldre-ho;si el pic principal apareix entre 80°C-90°C, i el pic miscel·lània torna a aparèixer quan augmenta la temperatura, bàsicament es considera que hi ha contaminació d'ADN, i cal eliminar l'ADN en la fase inicial de l'experiment.

Per descomptat, encara hi ha algunes situacions anormals, que es desglossaran una per una a continuació.
3. Coneixements avançats

Per fer qPCR, he de dir MIQE,Informació mínimaper a la publicació deQuantitativaPCR en temps realExperiments: la informació mínima per publicar articles sobre PCR quantitativa en temps realexperiments.Per tal de simplificar la comprensió de tothom, simplificarem el contingut clau.

Podeu cercar el text original de MIQE a Internet, i el més important és que estipula elllista de comprovació de dades que cal proporcionar quan es publica un article .

Els revisors poden jutjar la qualitat de l'experiment llegint aquests detalls;els futurs lectors també poden utilitzar-ho per repetir o millorar l'experiment.
Val a dir que en aquesta llista, la importància de cada llista està marcada amb E o D respectivament.Què vol dir?E: informació essencial (s'ha de presentar);D: informació desitjable (proporcioneu tant com sigui possible).

MIQE (1)—Disseny Experimental
Molts canalles que han completat la seva defensa després d'acabar els seus estudis de postgrau no sabran dissenyar un experiment de manera autònoma, obrir els seus quaderns i fer el que els digui el professor.Com a resultat, el disseny experimental no va ser rigorós, i el departament editorial de la revista va dir que volien inventar aquesta imatge i aquella imatge, així que ho van fer aturdits.Així es fan els canals!

Més a prop de casa, el primer principi de l'experiment és determinarel rigor de la lògica experimental.El més fonamental és el disseny experimental, i el més important del disseny experimental és com establir la mostra objectiu, la mostra de referència (control) i el nombre de repeticions, de manera que les dades experimentals es puguin referenciar, comparar i convincent.

La mostra objectiufa referència a la mostra que ens obliga a detectar el gen diana després d'un determinat tractament.La mostra de referènciaés la mostra sense cap tractament, que sovint es coneix com a tipus salvatge en biologia.

Rèpliques experimentalssón molt importants.En general, el nombre de rèpliques persuasives ha de ser superior a tres.Cal distingir què és replicació biològica i què és replicació tècnica.

Replicats biològics: El mateix experiment de verificació fet amb diferents materials (temps, plantes, lots, plaques de reacció).

Duplicació biològica
Prenem com a exemple el tractament amb pesticides del pebrot.Volem polvoritzar pesticides a les tres plantes d'ABC, llavors les tres plantes d'ABC són tres rèpliques biològiques, i són el mateix experiment de verificació realitzat amb materials diferents.Però com a experiment, definitivament es necessita un control, de manera que podem ruixar una de les branques de la planta A per formar un grup experimental de la planta A, i no ruixar les altres branques de la planta A per formar un grup de control.Feu el mateix per a B i C.

Rèpliques tècniques (Rèpliques tècniques): És un experiment repetit dissenyat per evitar errors causats pel funcionament, que en realitat és un forat duplicat inclòs en el mateix material.Tant els tractaments com els controls han de tenir paràmetres replicats (mínim tres) del gen objectiu i el gen de referència intern.

Repetició tècnica
Torneu a prendre com a exemple el pebrot tractat amb pesticides.Per al grup experimental de la planta A, vam fer tres forats de PCR d'1, 2 i 3 per al seu gen objectiu i el gen de referència intern respectivament, per tal de prendre la mitjana després de la detecció.Per al control de la planta A també es tracten els grups de la mateixa manera.De la mateixa manera, feu el mateix tractament per a les plantes B i C.Això és repetició tècnica.

Val la pena assenyalar-hoel que entra a les estadístiques és la repetició biològica, i la repetició tècnica és comprovar si hi ha fenòmens aleatoris en el procés experimental, per tal de fer creïbles els resultats experimentals, és a dir, per evitar errors prenent la seva mitjana com sovint diem.

Controls negatius: NTC i NRT
NTC (control sense plantilla), un control sense plantilla, s'utilitza per verificar si el material experimental està contaminat.En general, l'aigua s'utilitza com a plantilla.Si hi ha una reacció fluorescent, indica que s'ha produït contaminació per àcids nucleics al laboratori.

Aquestes contaminacions provenen de: aigua impura, reactius no qualificats que contenen ADN endogen, contaminació d'imprimació, contaminació d'equips de laboratori, contaminació d'aerosols, etc., necessitat d'utilitzar eliminadors de RNases i inhibidors de RNases.La contaminació per aerosol és la més difícil de trobar.Imagineu que el vostre laboratori és com el smog, amb diversos àcids nucleics suspesos a l'aire.

NRT (no transcriptasa inversa), el control sense transcripció inversa, és l'ARN transcrit no inversament com a control negatiu, que és el control del residu d'ADNg.

Quan es fa l'expressió gènica, la quantitat d'ARN es detecta detectant la quantitat d'ADNc després de la transcripció inversa.Si hi ha residus d'ADNg quan es purifica l'ARN, provocarà errors en els resultats experimentals, perquè els resultats reals obtinguts són ADNg i ADNc.A nivell agregat, no només l'ADNc, l'ADNg s'ha d'eliminar completament durant l'extracció d'ARN.

MIQE (2): informació de mostra
L'anomenada informació de mostra vol dir que quan publiquem un article sobre qPCR, hem d'explicar clarament la informació de la mostra, que és una part indispensable de l'article.De la mateixa manera, quan processem mostres, també hem de regular les nostres pròpies operacions per garantir la validesa de les mostres.

La descripció de la mostra és només un resultat, i hauríem de prestar més atenció als materials pres durant tot l'experiment.

Selecció de materials experimentals
Mostres de sang: trieu sang fresca, no més de 4 hores.Mostres cel·lulars: trieu recollir cèl·lules fresques en un període de creixement vigorós.Teixit animal: trieu teixit fresc i en creixement vigorós.Teixit vegetal: trieu teixit fresc i jove.

Deu haver notat que hi ha una paraula clau en aquestes poques frases: fresc .
Per a les mostres anteriors, el millor kit, rendible i estable del mercat és el kit de Foregene, que pot extreure el seu ADN i ARN de manera ràpida i senzilla.

Mini kit d'ADN de sang

Kit d'aïllament d'ARN total de cèl·lules

Kit d'aïllament d'ARN total animal

Kit d'aïllament d'ARN total de plantes

Kit d'aïllament d'ARN total de plantes Plus

Kit d'aïllament d'ADN vegetal

Emmagatzematge de materials experimentals
En general, no recomanem emmagatzemar mostres, si les condicions ho permeten.Tanmateix, hi ha molts amics que no poden dur a terme experiments immediatament després del mostreig, i alguns fins i tot necessiten portar tancs de nitrogen líquid al camp per al mostreig.

Per a aquest tipus d'amic treballador, només puc dir que no enteneu els consumibles de reactius.Ara moltes empreses de consumibles de reactius produeixen reactius que poden emmagatzemar mostres d'ARN a temperatura ambient, i podeu optar per utilitzar-los.El mètode d'emmagatzematge convencional és l'emmagatzematge de nitrogen líquid, utilitzant un petit dipòsit de nitrogen líquid que és fàcil de transportar.Després de portar la mostra de nou al laboratori, emmagatzemar-la en una nevera a -80 °C.

Per als experiments amb ARN, cal seguir el principi de sis paraules:baixa temperatura, sense enzims,iràpid .

El concepte de baixa temperatura és fàcil d'entendre;sense enzims, la RNasa es troba a tot arreu del món on vivim (en cas contrari t'hauries matat pel VIH), així que com evitar la RNasa en fer experiments és un concepte molt important;ràpid,No hi ha Kung Fu al món que no es pugui trencar, només la velocitat no es pot trencar.

Per tant, en cert sentit, com més curt sigui el temps d'extracció, millor serà el kit.Per què ho faForegeneEl kit posa l'accent en la velocitat, perquè la coneixen bé.

PD: Algunes noies fan experiments amb molta cura, però no són tan bones com un slam dunk després de diversos anys de treball.Sent que Déu és injust, es queixa dels altres i busca la vida.De fet, ella no ho va entendre.No va protegir bé l'ARN, i el jugador de slam dunk era àgil.Quan estava fent l'experiment, va pensar que acabaria el slam dunk amb tres vegades, cinc vegades i dues divisions, però va fer l'experiment bé.

Nota: Més lent, més possibilitats d'invasió de la RNasa.Com entrenar-se per ser ràpid?No hi ha manera, només practica més.

Per a diferents experiments i mostres diferents, encara és necessari llegir més literatura i triar un mètode adequat per al processament.Per al procés de recollida i emmagatzematge de mostres, MIQE requereix que s'hagi d'escriure clarament al document, de manera que els revisors puguin revisar la fiabilitat del document, i també és convenient que els joves atordits repeteixin l'experiment.

Tot i que els experiments biològics són difícils, són de gamma alta.Si no tens cura, pots capgirar el món.Per exemple, convertir el SARS en una crisi bioquímica o fer arròs híbrid per salvar 1.300 milions de persones.La imatge següent és un experiment químic, hauríeu d'entendre l'orgull que esteu de la vostra investigació només mirant la seva aparença semblant a una polla.Oblida't, no el facis negre.

MIQE (3) – extracció d'àcids nucleics.
L'extracció d'àcids nucleics és un gran esdeveniment, i tots els experiments de biologia molecular comencen amb l'extracció d'àcids nucleics.Primer de tot, copiem el contingut del MIQE sobre l'extracció d'àcids nucleics.

Mirant aquest formulari, no us podeu quedar a la superfície.La forma és un dogma.Per ser un estudiant de primer nivell, us heu de preguntar per què.El contingut essencial d'aquesta taula és: Perseguirla puresa, integritat, consistència i quantitat d'extracció de l'ARN .

La primera part de laprocés o instrument és l'etapa d'extracció de l'àcid nucleic.Si utilitzeu un extractor automàtic d'àcids nucleics per extreure (avançat, poseu-vos en contacte amb mi per a la compra), heu d'indicar el nom del model de l'instrument.

El nom del kit i

Quin kit s'ha utilitzat per als detalls del canvi, quins reactius especials s'han afegit o quines operacions especials s'han fet s'han d'explicar clarament perquè altres puguin repetir fàcilment l'experiment.

Algunes persones afegeixen alguns reactius especials en extreure mostres especials, pensant que aquesta és la seva arma secreta i no ho diuen als altres.Mentre ho mantenen en secret, també perden l'oportunitat de fer brillar el vostre article.No siguis intel·ligent, has de ser més honest que el vell Zhang en investigació científica, si vols ser intel·ligent, l'article et farà estúpid.

Cal recordar el número de producte del kitquan demaneu el kit i escriviu l'article.En general, hi ha dos números al kit: Cat: número de catàleg (número de producte, número d'article), Lot: número de lot de producte (S'utilitza per indicar de quin lot prové el producte).

A més, el número CAS s'utilitza sovint a l'hora de demanar reactius bioquímics, i el popularitzaré junts.El número CAS és el número donat per l'American Chemical Society a cada fàrmac químic nou.Generalment, tres nombres estan connectats per un guió.Número CAS de Rushui: 7732-18-5.Els productes químics sovint tenen diversos àlies, però el número CAS és únic.Quan demaneu medicaments, primer podeu comprovar el seu número CAS.

Més a prop de casa, per què hem de descriure aquestes coses amb claredat?De fet, també és per comprovar la qualitat de l'extracció d'ARN.L'ús d'instruments i kits farà que l'extracció d'ARN sigui més consistent.L'escala d'extracció dels laboratoris ordinaris no és gran i es pot obtenir amb kits.

Els detalls del tractament amb DNasa o RNasa
La qüestió important de la PCR quantitativa fluorescent és prevenir la contaminació de l'ADN i no experimentar si hi ha contaminació.Per tant, és imprescindible indicar el procés que heu utilitzat per processar l'ADN, per tal de demostrar que l'ADN en el procés experimental s'ha eliminat completament i completament.representat per un esquema esquemàtic.

Diagrama esquemàtic de l'ARN i l'ADN
En general, el mètode per eliminar l'ADN és tractar l'ARN amb DNasa després de l'extracció.No obstant això, aquests són mètodes relativament antics.Els kits comercials d'extracció d'ARN han estat capaços d'eliminar l'ADN durant el procés d'extracció sense afegir DNasa.Per exemple, una sèrie de kits de Foregene.

Nota: L'eliminació d'ADN durant l'extracció d'ARN és una arma de doble tall molt perillosa, que allargarà el temps de funcionament de l'extracció de l'ARN i augmentarà el risc de degradació de l'ARN.Bàsicament, és una compensació entre el rendiment i la puresa d'ARN.

A més, la quantitat de DNasa afegida a la columna d'adsorció basada en sílice és molt petita i s'ha d'utilitzar DNasa d'alta qualitat per aconseguir l'efecte.La DNasa no optimitzada no es pot digerir ràpidament i completament.Aquesta és una prova del nivell tècnic del comerciant.Per descomptat, hi ha encara més comerciants estranys que presumeixen que l'ADN es pot eliminar sense DNasa.Es pot dir que qualsevol persona que presumeix que l'ADN es pot eliminar completament sense DNasa és un gamberro.L'ADN és una estructura de doble cadena relativament estable i no es pot eliminar només parlant i rient.

Avaluació de la contaminació
mètode d'avaluació: detecció d'electroforesi, 1% d'agarosa, 6V/cm, 15min, càrrega 1-3 ul

Anàlisi quantitativa d'àcids nucleics
normalment es mesura amb un espectrofotòmetre UV.Primer vull popularitzar el significat dels tres valors de OD260, OD280 i OD230.
·OD260nm: és la longitud d'ona d'absorció del pic d'absorció més alt d'àcid nucleic, i el millor valor mesurat oscil·la entre 0,1 i 1,0.En cas contrari, diluïu o concentreu la mostra per posar-la dins del rang.
·OD280nm: És la longitud d'ona d'absorció del pic d'absorció més alt de proteïnes i substàncies fenòliques.
·OD230nm: És la longitud d'ona d'absorció del pic d'absorció més alt d'hidrats de carboni.

A continuació, parlem del paper de cada indicador.Per a A260, es pot utilitzar per mesurar el rendiment d'àcid nucleic.Quan OD260=1, dsDNA=50μg/ml, ssDNA=37μg/ml, ARN=40μg/ml.

Per a la puresa, hem de mirar les proporcions que veiem habitualment: OD260/280 i OD260/230.
·ADN pur: OD260/280 és aproximadament igual a 1,8.Quan és superior a 1,9, indica que hi ha contaminació per ARN, i quan és inferior a 1,6, indica que hi ha contaminació per proteïnes i fenols.
·ARN pur: 1,7
·OD260/230: Tant si es tracta d'ADN com d'ARN, el valor de referència és 2,5.Quan és inferior a 2,0, indica que hi ha contaminació de sucre, sal i matèria orgànica.

integritat de l'ARN

És molt important mesurar la integritat de l'ARN.En general, cal fer un experiment de gel de desnaturalització de l'ARN per comprovar si la brillantor entre l'ARN 28S i 18S és una relació doble.Quan apareix la tercera banda 5S, vol dir que l'ARN ha començat a degradar-se, excepte els invertebrats.

Dades per a l'avaluació de la qualitat de l'ARN: a més de les proves anteriors, també hi ha algunes proves d'instruments més avançades pel que fa a la integritat de l'ARN, com ara la prova d'integritat RQI del sistema d'electroforesi automàtic Experion, que pot detectar si l'ARN es degrada de manera invisible.

En la investigació científica, la PCR quantitativa fluorescent és una comparació entre el gen objectiu i el gen de referència intern.Per tant, en el procés de preservació de mostres d'ARN, extracció d'ARN, etc., l'objectiu principal és garantir la integritat de l'ARN.

Com la integritat de l'ARN afecta l'equilibri entre el gen objectiu i el gen de referència intern es pot entendre fàcilment a la figura següent.La degradació conduirà a la incompletitud del gen, tant si es tracta de la incompletitud del gen de referència intern com de la incompletitud del gen objectiu, tindrà un gran impacte en les dades.

El diagrama esquemàtic del gen objectiu i el gen de referència no ha de ser cert

Prova d'inhibició (si el valor de TC es suprimeix en concentració alta o baixa o en altres condicions)

Prenent aquesta figura com a exemple, els valors Ct de les cinc corbes són els següents.La distribució dels valors de CT entre les corbes és desigual i els valors de Ct es retarden a concentracions altes i baixes, com és el cas de la inhibició de la PCR.

Punt clau: En el procés d'extracció de l'ARN, hem d'abandonar les idees errònies i establir-ne de correctes.

La idea equivocada és: l'extracció d'ARN només persegueix el rendiment, pensant que com més gran sigui la quantitat d'ARN obtinguda, millor.De fet, quan fem quantificació, si el nombre de gens no és molt gran, no necessitem gaire ARN.La quantitat d'ARN que extreu és més que suficient.

El concepte correcte és:L'extracció d'ARN ha de perseguir la puresa, la integritat i la consistència.La puresa pot garantir que la transcripció inversa posterior no s'inhibeix i les dades no es veuran afectades per l'ADN.La integritat garanteix l'equilibri de seqüències de destinació i referències internes.La consistència garanteix una càrrega estable de la mostra.

MIQE (4) – transcripció inversa
Concepció errònia: la recerca d'un volum de mostra més elevat.
Concepte correcte: Perseguir la coherència (estabilitat), independentment de la quantitat d'ARN carregat, l'eficiència de la transcripció inversa segueix sent coherent, assegurant que les diferències en l'ADNc poden reflectir realment les diferències en l'ARNm.
Expliquem aquest procés amb un esquema esquemàtic:

Diagrama esquemàtic de l'eficiència de la transcripció inversa, no és cert
En primer lloc, hem d'entendre la diferència entre el procés de transcripció inversa i el procés de PCR.La PCR pateix múltiples processos d'escalfament i recuit, i el fragment objectiu creix de manera exponencial;mentre que la transcripció inversa no té aquest procés, podem imaginar que la transcripció inversa és en realitat un a un Durant el procés de replicació, tants trossos d'ARN

com hi ha pot obtenir tantes peces d'informació d'ADNc, ja s'hauria d'entendre, perquè els fragments grans i petits s'han transcrit de manera inversa i és impossible centrar-se en un fragment.I com que la quantitat d'ARN és relativament petita, la quantitat d'ADNc obtinguda també és relativament petita, a diferència de la PCR, que té un efecte d'amplificació, per la qual cosa és bàsicament impossible de detectar.

Resultats de l'electroforesi d'ADNc
En segon lloc, l'ideal és que la transcripció inversa es faci un a un, però cap transcriptasa inversa de cap empresa pot aconseguir aquest efecte.Bàsicament, l'eficàcia de la majoria de transcriptases inverses oscil·la entre el 30 i el 50%.Si aquest és el cas, preferirem tenir una eficiència de transcripció inversa relativament estable, que és el que volem veure a la figura: 3 ARN obtenen 2 ADNc, 6 ARN obtenen 4 ADNc, de manera que no importa quanta mostra es carregui, l'eficiència de la transcripció inversa és relativament estable.No volem veure la situació en què l'eficiència de la transcripció inversa és inestable i s'inhibeix l'alta concentració.

Aleshores, com verificar si l'eficiència de la transcripció inversa és estable?El mètode és molt senzill, només cal fer una prova de comparació: una és la transcripció inversa a l'ADNc després de duplicar la dilució de l'ARN, i l'altra és fer una dilució duplicada després de la transcripció inversa a l'ADNc, i després fer qPCR per veure el pendent obtingut és coherent?Com a millor estudiant, hauríeu d'entendre-ho en qüestió de segons.Com es mostra a continuació:

Dilució d'ARN i ADNc per comprovar si l'eficiència de la transcripció inversa és estable
Transcriptasa inversa i kit
Com pot la PCR quantitativa fluorescent perfecta tenir una transcriptasa inversa i un kit excel·lents.La transcriptasa inversa es divideix aproximadament en dos tipus segons la font, AMV oM-MLV, i el seu rendiment és el mateix que el que es mostra a la taula.

Activitat RNasa H
La RNasa H és la ribonucleasa H, el nom xinès és la ribonucleasa H, que és una endoribonucleasa que pot hidrolitzar específicament l'ARN a la cadena híbrida ADN-ARN.La RNasa H no pot hidrolitzar els enllaços fosfodièster en ADN o ARN monocatenari o bicatenari, és a dir, no pot digerir ADN o ARN monocatenari o bicatenari.S'utilitza habitualment en la síntesi de la segona cadena d'ADNc.

És una cosa estranya.Diem que la transcriptasa inversa té activitat RNasa H, no que la transcriptasa inversa conté RNasa H, i és possible que no sigui possible separar la RNasa H de la transcriptasa inversa, potser a causa de la conformació de certs grups en la transcriptasa inversa. Aquesta activitat és causada per la transcriptasa inversa.

Per tant, independentment de la major eficiència de transcripció inversa de l'AMV, la seva activitat RNasa H redueix el rendiment d'ADNc.Per descomptat, els fabricants de reactius optimitzen constantment els seus productes per eliminar l'activitat de la RNasa H a la transcriptasa inversa tant com sigui possible per augmentar el rendiment d'ADNc.
Temperatura de recuit

Estructura secundària de l'ARN a diferents temperatures
Consulteu la figura anterior per veure l'estructura secundària de l'ARN a diferents temperatures i utilitzeu l'eina en línia mFold per determinar l'estructura secundària del fragment objectiu en condicions específiques de temperatura i concentració de sal.A 55 °C, l'estructura secundària de l'ARN encara és molt complexa, la transcriptasa inversa no pot funcionar i l'estructura secundària no es pot resoldre completament fins a 65 °C, mentre que la temperatura òptima d'AMV i M-MLV és molt inferior a aquesta temperatura.
Què fer?L'estructura secundària és l'aparellament complementari de la plantilla pròpiament dita, la qual cosa comporta una forta competència entre l'encebador i la transcriptasa inversa i la plantilla, donant lloc a una sèrie de problemes com ara una baixa E i poca repetibilitat.

Què fer?Només augmentar la temperatura de recuit tant com sigui possible.

Molts fabricants de reactius estan millorant la seva transcriptasa inversa mitjançant l'enginyeria genètica.Alguns augmenten la temperatura de reacció, com Jifan i Aidelai, i alguns eliminen el grup actiu de l'enzim RNasa H per millorar l'afinitat entre l'enzim i la plantilla d'ARN.L'alta afinitat pot extreure de manera competitiva l'estructura secundària i llegir-la sense problemes, i també millorar molt l'eficiència de la transcripció inversa.
Punt clau: la transcripció inversa és més important per buscar la consistència de l'eficiència de la transcripció inversa (els enzims no només han de ser eficients, sinó també estables), en lloc de la quantitat de mostra carregada, si no es tracta d'una PCR quantitativa fluorescent a gran escala, no serà possible.ADNc múltiples.
Diversos fabricants també han fet alguns esforços en la recerca de la coherència.Per exemple, la majoria de les empreses ara han empaquetat la transcripció inversa com a kit estàndard per a la venda, que és una bona opció.
Per exemple, els kits de la sèrie RT Easy de Foregene:

RT Easy I (Premescla mestra per al kit de síntesi d'ADNc de primera cadena)

MIQE (5) - informació del gen objectiu

La figura anterior explica
1. En general, es pot comprovar si aquest gen és eficaç per a experiments repetits mitjançant experiments repetits.
2. Identificació del gen, ja ho saps.
3. Longitud del gen, la longitud total del gen objectiu definitivament no és cap problema.Quan dissenyeu cebadors, assegureu-vos que la longitud de l'amplicó estigui entre 80 i 200 pb per garantir una millor eficiència d'amplificació.
4. Informació de comparació de seqüències Blast, el gen objectiu s'ha de comparar al banc de gens per evitar l'amplificació inespecífica.
5. Presència de pseudogens.Un pseudogen és una seqüència d'ADN semblant a un gen normal però perd la seva funció normal.Sovint existeix a la família multigen dels eucariotes.Normalment es representa amb ψ.És una còpia d'ADN genòmica no funcional en el genoma que és molt semblant a la seqüència del gen codificant., generalment no es transcriuen i no tenen un significat fisiològic clar.
6. Posició dels cebadors respecte d'exons i introns.En els primers anys, quan vam resoldre el problema de la contaminació de l'ADN, sovint vam prestar atenció a les posicions dels primers, exons i introns, i en general vam considerar dissenyar cebadors entre introns per evitar l'amplificació de l'ADN.Si us plau, vegeu la figura següent: el negre representa introns, diversos blaus representen exons, rosa representa cebadors comuns i vermell brillant representa cebadors que abasten introns.

Esquemàtic, mai cert
Quin pla perfecte sembla, però de fet, en la majoria dels casos, els primers trans-intró no són tan màgics com s'imaginava, i també provocaran una amplificació inespecífica.Per tant, la millor manera d'evitar la contaminació de l'ADN és eliminar l'ADN completament.
7. Predicció de conformació.Tornant a utilitzar aquest exemple, utilitzeu l'eina en línia mFold per determinar l'estructura secundària del fragment objectiu a una temperatura i una concentració de sal específiques.

Estructura secundària de l'ARN a diferents temperatures
L'estructura secundària és l'aparellament complementari de la plantilla en si, que donarà lloc a una forta competència entre l'aparellament de l'imprimació i la plantilla, i les possibilitats d'unió de l'imprimació són menors, donant lloc a una sèrie de problemes com la baixa E i la poca repetibilitat.Mitjançant la predicció del programari, si no hi ha cap problema d'estructura secundària, seria genial.Si n'hi ha, el nostre article de seguiment tractarà específicament de com resoldre aquest problema.

MIQE (6)—Oligonucleòtids de qPCR

Per a la PCR quantitativa fluorescent, el primer que lluites cada dia és l'extracció d'ARN, i la segona cosa pot ser el disseny d'imprimació.
En primer lloc, encara comprovem les regles sobre el disseny d'imprimacions segons la llista de verificació MIQE.És tan senzill que els canalla poden riure, i ho podem acabar en una frase: esbrineu la seqüència i la posició de la sonda d'encebació i el mètode de modificació.Per al mètode de purificació d'imprimació, la síntesi d'imprimació és tan barata actualment, qPCR és digne de PAGE i mètodes de purificació superiors, i la informació de l'instrument de síntesi no és important.Molta gent fa dècades que fa primers i no sap que el sintetitzador és ABI3900.
Pel que fa als principis del disseny d'imprimacions, no cal memoritzar-los de memòria, perquè la majoria de programari de disseny de cartilla o eines en línia poden fer-se càrrec d'aquests problemes (eina en línia recomanada primer3.ut.ee/), i el 99,999% del disseny de cartilla no es fa manualment Mireu, l'autor de vegades dissenya centenars de cartografies al dia, si llegeixes una per una, es creuarà.
Només cal que comproveu els punts següents després de dissenyar les imprimacions:
1. Dissenyar cebadors propers a l'extrem 3': en el cas d'utilitzar cebadors oligo dT per a la síntesi de la primera cadena d'ADNc, tenint en compte l'eficiència de la transcripció inversa i la integritat de l'ARN, els primers dissenyats s'han de dissenyar prop de l'extrem 3' per millorar l'eficiència de l'amplificació.Feu servir una imatge per explicar el següent (no hi ha manera d'entendre-ho):

Per què els imprimadors s'han de dissenyar a prop de l'extrem 3′, no ha de ser cert
2. Valor TM: el valor de Tm es troba a 55-65 °C (perquè l'activitat de l'exonucleasa és la més alta a 60 °C), i el contingut de GC és del 40%-60%.
3. BLAST: per evitar l'amplificació inespecífica del genoma, s'ha d'utilitzar Blast per a la verificació suplementària.

MIQE(7)—procés de qPCR

1. Kit de qPCR
D'acord amb els requisits de MIQE, hem de descriure clarament les condicions de reacció completes a l'article, inclosa la configuració del sistema de reacció de PCR, quin kit s'utilitza, qui és el fabricant, quina mida és el sistema de reacció, si s'utilitza el mètode del colorant o el mètode de la sonda, la configuració del programa PCR.Sens dubte, els conductors veterans trobaran que, sempre que el kit sigui seleccionat, la informació anterior es determina bàsicament.
Actualment, la fabricació i producció de kits de PCR quantitatius fluorescents és una tecnologia molt madura.Mentre no trieu fabricants extremadament dolents, la probabilitat de problemes no és alta, però encara volem compartir amb vosaltres alguns punts:
Enzima Taq d'arrencada en calent:La part més important de la PCR és l'enzim Taq d'arrencada en calent.Els enzims d'inici en calent al mercat generalment es divideixen en dos tipus, un és un enzim d'inici en calent modificat químicament (pots imaginar-lo com a incrustació de parafina) i l'altre és un enzim d'inici en calent per a la modificació d'anticossos (unió antigen-anticossos).La modificació química és una de les primeres maneres d'arrencar en calent els enzims.Quan s'arriba a una determinada temperatura, l'enzim alliberarà la seva activitat.L'enzim d'inici en calent modificat amb anticossos utilitza mètodes biològics per bloquejar l'activitat de l'enzim.Quan s'arriba a una determinada temperatura, l'anticossos es desnaturalitzarà i s'inactivarà com a proteïna, i es posarà en joc l'activitat enzimàtica.

Tanmateix, per a què serveix això?Aquest és el cas, l'activitat d'alliberament dels enzims modificats amb anticossos és més ràpida que la dels enzims modificats químicament, de manera que en termes de sensibilitat, els enzims modificats amb anticossos tenen un lleuger avantatge, de manera que bàsicament no hi ha enzims modificats químicament als kits del mercat.Si n'hi ha, aleshores la tecnologia d'aquest fabricant encara està encallada a l'era del mil·lenni.
Concentració d'ions magnesi:La concentració d'ions magnesi és molt important en la reacció de PCR.Una concentració adequada d'ions magnesi pot promoure l'alliberament de l'activitat enzimàtica Taq.Si la concentració és massa baixa, l'activitat de l'enzim es reduirà significativament;si la concentració és massa alta, es millorarà l'amplificació no específica catalitzada per enzims.La concentració d'ions de magnesi també afectarà el recuit dels primers, la temperatura de fusió de la plantilla i els productes de PCR, afectant així el rendiment de fragments amplificats.La concentració d'ions de magnesi es controla generalment a 25 mM.Per descomptat, per a un bon kit, la concentració d'ions de magnesi ha d'estar ben controlada.Alguns comerciants afegeixen un agent quelant d'ions de magnesi al reactiu, que pot aconseguir l'efecte d'ajust automàtic de la concentració d'ions de magnesi.
Concentració de colorant fluorescent:El colorant fluorescent, que és el verd SYBR que utilitzem habitualment, genera fluorescència principalment en unir-se al solc menor de l'ADN bicatenari, perquè la unió del colorant a l'ADN bicatenària és inespecífica, és a dir, mentre s'hi combini l'ADN bicatenària, es pot produir fluorescència, de manera que els dímers imprimadors i els senyals d'ADN es combinaran en el sistema.
PS: a causa de les seves propietats sensibles a la llum, els productes del mercat s'envasen generalment en tubs de centrífuga opacs de color marró (com es mostra a la imatge següent).Tanmateix, això trobarà un problema.És difícil veure si el líquid és xuclat durant el mostreig.En aquest sentit, Qingke és realment el més fàcil d'utilitzar (com es mostra a la imatge següent), i el tub transparent està empaquetat en una bossa de llauna opaca.A continuació, poseu-lo en una bossa de llauna, tenint en compte la comoditat d'evitar la llum i el mostreig.Heu de triar el número de producte adequat.TSE204 és una existència súper rendible, que em fa venir ganes de plantar gespa.

La concentració del colorant fluorescent també és molt important.Si la concentració és massa baixa, la corba d'amplificació no pujarà en l'etapa posterior i no és perfecta;si la concentració és massa alta, provocarà interferències de soroll.Com que la PCR quantitativa fluorescent depèn principalment del valor CT, si la concentració del colorant fluorescent no s'ajusta correctament, el punt baix és millor que el punt alt.Per descomptat, la concentració de colorant adequada és la millor.

ROX: Els colorants ROX s'utilitzen per corregir els errors de senyal de fluorescència de pou a pou.Alguns fabricants d'instruments requereixen calibratge, mentre que altres no.Per exemple, l'ús de l'instrument d'amplificació de PCR en temps real de Thermo Fisher Scientific sol requerir un calibratge, que inclou 7300, 7500, 7500Fast, StepOnePlus, etc. Les instruccions generals del kit ho descriuen.
El qPCR Mix de Foregene també conté colorant ROX, que és convenient per utilitzar-lo en diversos models.

Kit de PCR en temps real-Taqman

Tractament d'enllaç d'hidrogen feble: El tractament dels enllaços d'hidrogen febles és una qüestió relativament tècnica.Res ha llegit els manuals de molts kits, però cap d'ells va mencionar aquest tema.De fet, és molt important.La combinació de bases depèn principalment de la força dels enllaços d'hidrogen.Els enllaços d'hidrogen forts són una amplificació normal, i els enllaços d'hidrogen febles condueixen a una amplificació inespecífica.Si no es poden eliminar bé els enllaços d'hidrogen febles, no es pot evitar l'amplificació inespecífica.Dins l'àmbit de l'autor, només unes poques empreses han notat aquest problema.Quan compreu el kit, podeu consultar si heu plantejat una solució en aquest sentit per al kit que voleu triar.

Volum de reacció: El sistema 20-50ul s'utilitza més habitualment, i és probable que volums més petits causin errors.En termes generals, les instruccions del kit recomanaran l'ús de volums de reacció de PCR.No sigueu intel·ligents i utilitzeu volums més petits per estalviar costos.l'objectiu de.En realitat s'ha provat el volum recomanat pels comerciants, i pot ser que no puguin resoldre el problema dels errors provocats per volums petits.
2. El fabricant i el número d'article de la placa del tub
Tothom coneix el principi de la PCR quantitativa fluorescent.La recollida de fluorescència es realitza principalment mitjançant taps de tubs de PCR.Quan escolliu consumibles de PCR, presteu atenció a dos punts: bona transmissió de la llum i adequat per a l'instrument.En general, les taules i tubs de les marques principals estan bé, però cal triar amb cura pel que fa a l'adaptació, en cas contrari no podreu utilitzar l'instrument.

4. Coneixements de primer nivell

MIQE (8)—validació de qPCR
Aquesta és la màxima prioritat de qPCR!Tants herois han caigut a la sorra aquí.Per descomptat, també és possible que tingueu sort i els gens que vau estudiar siguin senzills, així que vau surar per la cova de gel al llarg del vent.La informació de verificació de qPCR està destinada a provar la fiabilitat de les dades.Enumerem la informació de verificació necessària de la següent manera:

1.Prova d'especificitat
L'especificitat de l'amplificació del gen objectiu es prova comprovant si la imatge d'electroforesi és una banda única;verificació de la seqüenciació;corba de fusió per veure si el mapa de pics és únic;verificació de la digestió enzimàtica i altres mètodes.
Aquí, ens centrem en tl'anàlisi de l'amplificació inespecífica mitjançant el mètode de les corbes de fusió.En termes generals, quan dissenyem imprimadors, cal que la mida del fragment del producte estigui en el rang de 80-200 pb, cosa que fa que la temperatura de fusió del producte de PCR sigui de 80-85 °C.Per tant, si hi ha pics diversos, hi ha d'haver altres productes d'amplificació inespecífics;si el pic apareix per sota dels 80 °C, generalment es considera un dímer d'imprimació;si el pic apareix per sobre dels 85 °C, generalment es considera contaminació d'ADN o més Amplificació inespecífica de fragments grans.
Nota: De vegades només hi ha un sol pic a 80 °C.En aquest moment, s'ha de respectar aquest concepte.És probable que els resultats de l'amplificació siguin tots dímers d'imprimació.

Corba de fusió normal (pic únic sense amplificació no específica)

Corba de fusió problemàtica (amplificació no específica de pics espúris)
【Anàlisi de casos】

Hi ha un pic principal, però el dímer d'imprimació és greu
La corba de fusió d'un sol pic de la figura següent pot enganyar fàcilment els vostres ulls, pensant que és un experiment perfecte, però el resultat és completament equivocat.En aquest moment, hem de mirar la temperatura de fusió.La temperatura màxima és per sota dels 80 °C, que és completament imprimació-dímer.

Cap fragment objectiu, tots els dímers d'imprimació
Aquí, el meu germà no pot parar.La imatge de sota és una foto feta amb un telèfon mòbil que m'ha enviat un canalla.Els reactius que va utilitzar són marques d'ús habitual a la indústria.Va canviar d'una marca de prefix T a una altra marca de prefix T.Crec que ja ho has endevinat.El canalla em va cridar: “El reactiu utilitzat a la primera imatge és massa bo i el pic és únic.Més tard, després d'utilitzar el reactiu que recomaneu, esdevé com la segona imatge, amb pics barrejats.M'has fet miserable.“
Separa els dos gràfics.A primera vista, un té un sol pic, i l'altre un doble pic.Tonteria, un sol pic està bé.És cert?
Pitjor que Dou E, si poso les dues imatges de la imatge següent, ho entendràs immediatament.De fet, estem fàcilment paralitzats per aquest tipus d'imatges.Després d'una anàlisi acurada, vam trobar que: el pic de la primera figura es troba a 75 °C, que és completament dímer d'imprimació;el pic de la segona figura apareix a 75°C i 82°C, almenys n'hi ha El producte apareix.

Imatges de comentaris dels alumnes
Per tant, el problema fonamental no és el problema dels reactius, sinó el problema del disseny de la imprimació.Al mateix temps, també demostra que algunes grans marques no són de qualitat de ferro, i també demostra el que va dir el meu germà abans: no és la marca de reactiu que dóna suport al teu article.És el vostre article el que va apuntalar la marca de reactius.Imagineu-vos que si la canalla no canviés els reactius, les dades equivocades s'enviarien a la revista i el que passaria seria una tragèdia.
2. Valor Ct del control en blanc
No expliqueu, si el control en blanc té un valor Ct, no és contaminació?Tanmateix, encara heu d'entendre quin control en blanc té un valor Ct.Si és NTC, vol dir que hi ha ADN estrany, com ara contaminació per reactiu.Si és NRT, vol dir que l'ARN extret té contaminació d'ADN.
3. Corba estàndard
Incloent el pendent i la fórmula de càlcul, l'eficiència de la PCR es pot calcular mitjançant la fórmula.Un experiment perfecte requereix que el pendent de la corba estàndard s'aproximi a 3,32 i que R² s'acosti a 0,9999.
4. Interval dinàmic lineal
El rang dinàmic de la reacció és lineal.Segons la plantilla utilitzada per generar la corba estàndard, el rang dinàmic hauria d'incloure almenys 5 gradients de concentració i prestar atenció al canvi dels valors de Ct a gradients de concentració alts i gradients de concentració baixos.
5. Precisió de detecció
Els canvis en els resultats de qPCR, és a dir, poca repetibilitat, és a dir, poca precisió, són causats per molts factors, com ara la temperatura, la concentració i el funcionament.La precisió de qPCR generalment es fa menys controlable a mesura que disminueix el nombre de còpies.Idealment, aquesta variació tècnica hauria de ser diferent de la variació biològica, i les rèpliques biològiques poden abordar directament les diferències estadístiques en els resultats de qPCR entre grups o tractaments.En particular, per als assajos de diagnòstic, s'ha d'informar de la millor precisió entre assaigs (repetibilitat) entre els llocs i els operadors.
6. Eficiència de detecció i LOD (en qPCR múltiple)
LOD és la concentració més baixa del 95% de les mostres positives detectades.En altres paraules, la concentració de LOD continguda en un conjunt de rèpliques de gens objectiu no hauria de superar el 5% de les reaccions fallides.Quan es fa una anàlisi qPCR múltiple, especialment per a la detecció simultània de mutacions puntuals o polimorfismes, la qPCR múltiple ha de proporcionar proves que la precisió de diversos fragments diana no es compromet al mateix tub, la detecció múltiple i la detecció d'un sol tub L'eficiència i el LOD haurien de ser els mateixos.Especialment quan els gens objectiu d'alta concentració i els gens objectiu de baixa concentració s'amplifiquen simultàniament, cal prestar atenció a aquest problema.
Problemes i solucionsEn termes generals, els problemes que sovint es troben en la depuració de qPCR se centren en els aspectes següents:
·amplificació inespecífica
· Difícil elecció de la concentració d'imprimació i problemes amb els dímers d'imprimació
·La temperatura de recuit és imprecisa
·L'estructura secundària afecta l'eficiència de l'amplificació
amplificació inespecífica
amplificació inespecíficaes produeix, generalment es considera si el disseny d'imprimació no és adequat, però si no teniu pressa per canviar les imprimacions, primer podeu provar els mètodes següents (també s'adjunta el principi):
·Augmentar la temperatura de recuit: intenteu que els enllaços d'hidrogen febles no es puguin mantenir;
· Escurçar el temps de recuit i allargament: redueix la possibilitat d'enllaços d'hidrogen febles;
·Reduir la concentració d'imprimació: redueix la possibilitat d'unió d'encebadors redundants i regions no objectiu;
Baixa eficiència d'amplificació
La situació oposada a l'amplificació no específica: baixa eficiència d'amplificació i les mesures per fer front a una baixa eficiència d'amplificació són justament el contrari:
·Ampliar el temps de recuit i allargament;
·Canviar a PCR de tres passos i reduir la temperatura de recuit;
·Augmentar la concentració d'imprimació;
Ps: Molts estudiants graduats nascuts als anys 90 no estan disposats a estudiar com depurar experiments i esperen que el kit pugui resoldre completament el problema (si voleu anar a una empresa de reactius per fer investigació i desenvolupament després de la graduació), de fet, els fabricants de reactius també pensen d'aquesta manera, espero que sigui un ximple. factors d'absorció d'enllaços.Per resoldre fàcilment el problema, els ximples encara han de llegir la introducció de la companyia de reactius per veure si hi ha un factor que absorbeix els enllaços d'hidrogen febles.
Difícil elecció de la concentració d'imprimació i problemes amb els dímers d'imprimació
Mètode 1: En general, les instruccions del kit per a qPCR tenen sistemes recomanats i concentracions d'imprimació recomanades.
Mètode 2: Depuració mitjançant l'establiment del gradient de concentració d'imprimació.La imatge següent ha estat robada a una empresa per il·lustrar-ho.La figura següent mostra els resultats quantitatius de fluorescència realitzats amb tres gradients de concentració d'imprimació (100nM, 250nM, 500nM) i quatre gradients de concentració de plantilla (0,1ng, 1ng, 10ng, 100ng).El valor Ct dels resultats experimentals es representa de la següent manera:

Selecció de concentració d'imprimació Concatena cada concentració d'imprimació en una línia de la següent manera:

L'elecció de la concentració d'imprimació és òbvia, la relació lineal de la concentració d'imprimació de 100 nM i 250 nM és millor i la relació lineal de la concentració d'imprimació de 500 nM és relativament pobra.En 100 nM i 250 nM, el valor Ct de 250 nM és relativament petit, de manera que la concentració òptima d'imprimació és de 250 nM.En general, es poden observar dímers imprimadors greus a la corba de fusió.Què passa si els imprimadors dissenyats no poden evitar els dímers imprimadors?
Mètode 3: Redueix la quantitat d'imprimacions i augmenta la temperatura de recuit (no cal explicar-ho).
El valor empíric de la temperatura de recuit és de 60 °C.Si no esteu segur, com seleccionar una temperatura de recuit més adequada?La resposta és la mateixa que l'elecció de la concentració d'imprimació:prova de gradient.Feu una foto de l'empresa Bio-rad per il·lustrar el problema.Per a l'amplificació d'un fragment objectiu determinat, establiu vuit gradients de temperatura, cadascun amb tres repeticions, i la corba d'amplificació obtinguda és la següent:

selecció de la temperatura de recuit:
·70 °C, 69 °C: bàsicament, els primers no es poden combinar, de manera que no hi ha amplificació.
·67,3 °C: hi ha una petita quantitat d'amplificació al principi i el valor de Ct és relativament gran.
·64,5°C——El valor Ct disminueix.
·A 60,7 °C, 58,0 °C, 56,2 °C i 55,0 °C, els valors de Ct tendeixen bàsicament a ser estables, però els valors de fluorescència finals eren diferents.
Com triar?Principi: el primer principi és el valor Ct més alt.Per al mateix valor de Ct, trieu una temperatura de recuit més alta per evitar la dimerització i l'amplificació inespecífica.Tot i que hi ha un valor de fluorescència més alt a 55 °C, pot haver-hi dímers o amplificació inespecífica.
Però si ets tan intel·ligent com tu, sens dubte pensaràs: lògicament parlant, si la reacció de PCR és molt específica, sempre que la concentració d'imprimació superi el requisit mínim, els punts alts i baixos no haurien de tenir cap efecte, igual que els colorants fluorescents i els dNTP.De fet, sempre que la temperatura de recuit s'optimitzi correctament, l'efecte de la concentració d'imprimació sobre el valor de Ct es minimitzarà naturalment.

La temperatura de recuit s'optimitza correctament i es minimitzarà l'efecte de la concentració d'imprimació en la TC
L'estructura secundària afecta l'eficiència de l'amplificació
Prenem la foto de Bio-rad per il·lustrar el problema.També dissenya un gradient de temperatura per amplificar un gen amb una estructura secundària.

Apareix una estructura secundària
Es pot veure que a mesura que disminueix el gradient de temperatura, comencen a aparèixer productes i el valor de Ct avança, arribant al valor mínim a 60,7 °C, i després a mesura que el gradient de temperatura disminueix, el valor de Ct es fa més gran.Per contra, a mesura que augmenta la temperatura, s'obre l'estructura secundària i augmenta l'eficiència d'amplificació.Després d'arribar a una determinada temperatura, augmentar la temperatura no pot millorar l'eficiència de l'amplificació.Com que els primers no es poden combinar de manera estable en aquest moment.Per tant,cerqueu la temperatura amb el valor Ct més baix, que és la millor temperatura per amplificar la plantilla d'estructura secundària!Per descomptat, els ximples intel·ligents han de saber que si no és necessari, el millor és canviar les imprimacions i evitar la regió d'estructura secundària.
5. Nivell d'aplicació
MIQE—Anàlisi de dades

L'anàlisi de dades ve donada principalment per l'instrument quantitatiu de PCR fluorescent.En l'article anterior s'ha fet un gran treball d'anàlisi de dades, com el control en blanc, que s'ha explicat en el disseny de l'experiment.S'han aclarit els gens de referència interna, els números repetits, etc., aquí expliquem principalment l'aplicació de qPCR.
La qPCR s'utilitza àmpliament i la verificació experimental i el diagnòstic d'àcids nucleics són els escenaris més utilitzats.
quantificació absoluta
Log (concentració inicial) té una relació lineal amb el nombre de cicles.Es pot dibuixar una corba estàndard a partir d'un estàndard amb nombre de còpia inicial conegut, és a dir, es pot obtenir la relació lineal de la reacció d'amplificació.Segons el valor Ct de la mostra, es pot calcular la concentració de la mostra.La quantitat de plantilles a incloure.

Mètode de càlcul quantitatiu absolut
La quantificació absoluta s'ha de basar en la corba estàndard.Per fer una corba estàndard, cal un estàndard.Normalment, l'estàndard és un plasmidi obtingut clonant el gen objectiu.Per què és un plasmidi?Perquè l'ADN plasmidi circular és el més estable.Diluïu el producte estàndard en 5 a 6 gradients segons la proporció de duplicació (dilució de 10 vegades) i presteu atenció a la uniformitat en diluir.Deixeu que el valor Ct caigui entre 15-30.

Preparació estàndard
Al mateix temps, la mostra a provar també s'ha de diluir en conseqüència (recordeu el factor de dilució) i el valor de Ct també hauria de caure entre 15-30.El producte estàndard + la mostra a provar es col·loquen a la màquina junts.Després de la prova, es va fer una corba estàndard amb la substància estàndard i les mostres a provar es van introduir a la corba estàndard per calcular la concentració.
La quantificació del VHB del virus de l'hepatitis B és una quantificació absoluta típica, que pot calcular el nombre de còpies del virus en 1 ml de sang.
Càlcul del número de còpia
Concentració de la mostra a provar (ng/ul) = DO260 × 50 ug/ml × factor de dilució
Pes molecular de la mostra = nombre de bases × 324
El número de còpia de la mostra a provar (còpies/ul) = la concentració de la mostra a provar / el pes molecular de la mostra × 6 × 1014

Mètode de càlcul del número de còpia

L'anterior és el mètode de càlcul per determinar la quantitat.Aquest és un problema matemàtic que es pot resoldre després de graduar-se a l'escola secundària, i els problemes matemàtics generalment es resolen amb ordinadors.Si no ho entens, pots venir a comunicar-te.
quantificació relativa
La quantificació relativa s'utilitza principalment en la investigació científica.Quants virus hi ha en 1 ml de sang, i és un virus d'ADN, aquest és un esdeveniment relativament determinista: es pot determinar la quantitat de sang i el virus d'ADN és relativament estable.Tanmateix, ens és difícil comparar el nombre de còpies de transcripció d'un determinat gen en una fulla, perquè és difícil determinar la mida, el pes i la tendresa de la fulla, la quantitat d'ARN extret és difícil de determinar i l'eficiència de la transcripció inversa també és difícil de determinar, és a dir, qualsevol pas pot fer que les dades experimentals tinguin errors i no es puguin utilitzar.
Per tant, la quantificació relativa ha d'introduir un element:el gen de referència interna.
En altres paraules, la quantificació relativa és en realitat una comparació entre el gen objectiu i el gen de referència intern.En comparació amb el mateix teixit i la mateixa cèl·lula, la influència de la mida de la mostra, la quantitat d'extracció d'ARN, l'eficiència de la transcripció inversa i l'eficiència de la PCR és relativament petita.A causa de la petita mida de la mostra, tant els gens de referència interns com els gens objectiu es van reduir relativament.És per això que abans hem posat èmfasi en la uniformitat i l'estabilitat.
Els gens de referència interna són generalmentgens de la llar(gens domèstics), que fan referència a una classe de gens que s'expressen de manera estable a totes les cèl·lules, i els seus productes són necessaris per mantenir les activitats vitals bàsiques de les cèl·lules.
No confongueu aquest concepte.Els gens de neteja són termes de funció biològica, mentre que els gens de referència interns són termes tècnics experimentals.Els gens de neteja han de passar la validació abans de poder seleccionar-se com a gens de referència interns.
Per exemple, vam seleccionar diversos gens domèstics a la figura següent per provar els seus nivells d'expressió en diferents cèl·lules del teixit i vam trobar que els nivells d'expressió de β-2-microglobulina eren força diferents dels dels altres tres gens, de manera que no es podien utilitzar com a gens de referència interns.

Després d'entendre la funció de correcció del gen de referència intern, es deriven dos algorismes a causa de la introducció del gen de referència intern.
·Mètode de doble corba estàndard
·2 – Mètode △△Ct (mètode de comparació de valors CT)
Si esteu interessats a estudiar les espècies i les funcions dels gens, si us plau, renuncieu a la recerca sobre algorismes i utilitzeu fórmules directament, o utilitzeu màquines directament;si sou un home heterosexual en matemàtiques i enginyeria, no dubteu.
mètode de doble corba estàndard
Quantifiqueu el gen objectiu i el gen de neteja de la mostra de control i la mostra que s'ha de provar mitjançant la corba estàndard i, a continuació, calculeu el valor relatiu segons la fórmula de càlcul, que és el nivell d'expressió relatiu.
Avantatges: anàlisi simple, optimització experimental relativament senzilla
Desavantatge: per a cada gen, cada ronda d'experiments ha de fer una corba estàndard
Aplicació: un dels dos mètodes quantitatius relatius més utilitzats i reconeguts en l'estudi de la regulació de l'expressió gènica.
La fórmula és la següent:

Els exemples són els següents:

Calcula la quantitat relativa a partir del resultat quantitatiu
2 – Mètode △△Ct (mètode de comparació de valors CT)

Avantatges: No cal fer una corba estàndard
Desavantatges: se suposa que l'eficiència d'amplificació és propera al 100%;la desviació estàndard és < 5% i s'assumeix que la corba estàndard i l'eficiència entre cada amplificació són coherents;l'optimització de les condicions experimentals és més complicada.
Aplicació: un dels dos mètodes quantitatius relatius més utilitzats i reconeguts en l'estudi de la regulació de l'expressió gènica.

Per descomptat, l'eficiència d'amplificació sol ser impossible de ser perfectament 1. Mètode de correcció: si sabem que el gen objectiu i el gen de referència tenen la mateixa eficiència d'amplificació, però l'eficiència d'amplificació no és igual a 1, aleshores 2－△△Ct es pot corregir com: (1+E )－△△Ct, per exemple, es pot corregir l'eficiència d'amplificació, per exemple, si es pot corregir l'eficiència d'amplificació 95. 1,95－△△Ct
Fins ara, el contingut sobre la PCR quantitativa fluorescent ha arribat a la seva fi.