La columna tapat

Després de l'obturació de la columna, el rendiment d'ARN es redueix o fins i tot impossible de purificar l'ARN, i la massa d'ARN obtinguda és baixa.

Anàlisi de la causa comuna:

1. Les pauses de mostra no són exhaustives.

El trencament de la mostra no fa que la COLUMNA DE NETEJA D'ADN es bloquegi completament, alhora que afecta el rendiment i la qualitat de l'ARN.Recomanem una operació de mòlta ràpida en un nitrogen líquid suficient quan es trenquin les mostres, intenteu aixafar la paret cel·lular de la mostra, la membrana cel·lular i altres teixits.Per a mostres de plantes de polisacàrids de poliol, us recomanem que utilitzeu Plant Total RNA ISOLATION KIT PLUS.

2. Quan aspira el sobrenedant de la mostra separada amb la columna de neteja d'ADN, es pot inhalar el possible precipitat fragmentat de cèl·lules.

Els sediments fragmentats de cèl·lules pres provocaran la columna NOMÉS ARN que es bloquejarà quan es realitzi l'operació d'adsorció d'ARN (vegeu el pas 6).Us recomanem amb cura quan succioneu aquest sobrenedant per evitar la succió de restes cel·lulars.

3. La quantitat inicial de la mostra és massa.

L'ús excessiu de la mostra provocarà una fragmentació incompleta de la mostra o una lisi cel·lular incompleta per part del buffer PSL1, cosa que provocarà un bloqueig de la columna de purificació durant la purificació.Kit d'aïllament d'ARN total de planta Cada mostra operativa purificada és de 50 mg.Per a mostres de plantes de polisacàrids de poliol, us recomanem que proveu Plant Total RNA ISOLATION KIT PLUS.

4. La temperatura de la centrífuga és massa baixa.

Tot el procés d'aïllament i purificació de l'ARN es porta a terme a temperatura ambient (20-25°C), tret que el teixit de la mostra es trenca amb nitrogen líquid. La temperatura d'algunes centrífugues criogèniques és inferior a 20℃, que pot causar bloqueig de la columna de neteja d'ADN i/o de la columna només d'ARN.Si això passa, establiu la temperatura de la centrífuga a 20-25℃, iAssegureu-vos que la barreja de lisi i/o el sobrenedant afegit d'etanol s'ha preescalfat a 37°C.

No s'ha extret ARN o el rendiment d'ARN és baix

Normalment hi ha molts factors que afecten l'eficiència de la recuperació, com ara: el contingut d'ARN de la mostra, el mètode d'operació, el volum d'elució, etc.

Anàlisi de les causes comunes de la següent manera:

1. Durant l'operació es va realitzar un bany de gel o una centrifugació a baixa temperatura (4 °C).

Suggeriment: Operar a temperatura ambient (15-25°C) en tot el procés, no feu bany de gel i centrifugació a baixa temperatura.

2.L'ARN s'ha degradat a causa d'una conservació inadequada de la mostra o de la conservació a llarg termini de la mostra.

Recomanació: les mostres acabades de recollir s'han de congelar ràpidament en nitrogen líquid i després emmagatzemar-les a -80 ° C durant molt de temps, evitar la congelació i descongelació repetida de les mostres;o remullar immediatament les mostres en una solució estabilitzadora d'ARN RNAlater (mostres animals).

3. La fragmentació i la lisi insuficients de la mostra condueixen al bloqueig de la columna de purificació.

Suggeriment: quan tritureu el teixit, assegureu-vos que el teixit estigui prou mòlt i transferiu-lo ràpidament al buffer PSL1 pre-preparat (confirmeu que s'ha afegit la proporció correcta de β-ME, vegeu el pas 1 del procediment).

4. L'eluent s'ha afegit incorrectament.

Suggeriment: assegureu-vos que el ddH2O lliure de RNasa es degota al mig de la membrana de la columna de purificació.

5.El volum correcte d'etanol absolut no es va afegir al tampó PSL2 o al tampó PRW2.

Suggeriment: seguiu les instruccions, afegiu el volum correcte d'etanol absolut a Buffer PSL2 i Buffer PRW2 i barregeu bé abans d'utilitzar el kit.

6.La quantitat de mostra de teixit és inadequada.

Suggeriment: Utilitzeu 50 mg de teixit per 500 μl de Buffer PSL1.L'ús de massa teixit reduirà la quantitat d'ARN extret i també es reduirà la puresa de l'ARN resultant.Recomanem fermament que la dosi inicial de la mostra no superi els 50 mg per operació d'extracció d'ARN.

7.Volum d'elució inadequat o elució incompleta.

Suggeriment: El volum d'eluent de la columna de purificació és de 50-200 μl;si l'efecte d'elució no és satisfactori, es recomana allargar el temps a temperatura ambient després d'afegir ddH2O sense RNasa preescalfat, com ara 5-10 minuts.

8.La columna de purificació té residus d'etanol després del rentat amb BufferPRW2.

Suggeriment: si el tub buit es centrifuga durant 1 min i encara queda etanol després del rentat al buffer PRW2, podeu augmentar el temps de centrifugació del tub buit a 2 min, o col·loqueu la columna de purificació a temperatura ambient durant 5 min per eliminar completament l'etanol residual.

9.El kit s'ha utilitzat incorrectament.

Suggeriment: per a mostres de plantes de polisacàrids polifenòlics, és possible que amb kits habituals com ara Plant Total RNA Isolation Kit no es puguin obtenir mostres d'ARN ideals.Us recomanem que utilitzeu Plant Total RNA IsolationKit Plus, que està especialment dissenyat per a mostres de plantes de polisacàrids polifenòlics.Un kit desenvolupat especialment per extreure ARN de mostres de plantes de polifenols i polisacàrids.

El valor OD260/OD280 és baix

L'elució d'ARN amb ddH2O i utilitzada per a les lectures de l'espectrofotòmetre dóna com a resultat valors baixos de OD260/OD280.Recomanem utilitzar 10 mM de Tris-HCl, pH 7,5 (en lloc de ddH2O lliure de RNasa per eluir l'ARN) per obtenir valors OD260/OD280 relativament correctes, vegeu “Assajos de concentració i purificació d'ARN” a la pàgina 19.

L'ARN purificat es degrada

La qualitat de l'ARN purificat està relacionada amb factors com la conservació de la mostra, la contaminació de la RNasa i la manipulació.

Anàlisi de causes comunes:

1.Les mostres de teixit no es van emmagatzemar a temps després de la recollida.

Recomanació: si les mostres de teixit no s'utilitzen a temps després de la recollida, emmagatzemeu-les en nitrogen líquid a baixa temperatura immediatament o transferiu-les a -80 ° C per a un emmagatzematge a llarg termini després de la congelació ràpida en nitrogen líquid, o submergiu les mostres immediatament en una solució estabilitzadora d'ARN RNAlater (mostres animals).Per a l'extracció d'ARN, proveu d'utilitzar mostres de teixit acabades de recollir.

2. Congelació i descongelació repetida de mostres de teixit.

Suggeriment: En emmagatzemar mostres de teixit, el millor és tallar-les en trossos petits per conservar-les, i treure'n una part quan les utilitzeu per evitar la degradació de l'ARN provocada per la congelació i descongelació repetida de les mostres.

3.La RNasa s'introdueix a la sala d'operacions o no es fa servir guants d'un sol ús, mascaretes, etc.

Suggeriment: els experiments d'extracció d'ARN es realitzen millor en operacions d'ARN separades, i la taula de laboratori s'ha de netejar abans de l'experiment, i s'han de portar guants i màscares d'un sol ús durant l'experiment per evitar la degradació de l'ARN causada per la introducció de RNasa en la major mesura.

4.El reactiu està contaminat per RNasa durant l'ús.

Suggeriment: substituïu-lo per una nova sèrie de kits d'extracció d'ARN total de plantes per a experiments relacionats.

5. Els tubs de centrífuga i les puntes de pipeta utilitzats per a la manipulació de l'ARN estan contaminats amb RNasa.

Suggeriment: assegureu-vos que els tubs de centrífuga, les puntes de les pipetes, les pipetes, etc. utilitzats en l'extracció d'ARN no contenen RNases.

Manuals d'instruccions:

Plant Total RNA Isolation Kit Plus Manual d'instruccions