Kit de qPCR de Cell Direct RT: SYBR GREEN I Kits de qRT-PCR d'un sol pas per a la lisi cel·lular directa
Descripcions
Aquest kit utilitza un sistema de tampó de lisi únic que pot alliberar ràpidament l'ARN de les mostres de cèl·lules cultivades per a reaccions RT-qPCR, eliminant així el procés de purificació d'ARN laboriós i que requereix molt de temps.La plantilla d'ARN es pot obtenir en només 7 minuts.El 5×Direct RT Mix i 2×Els reactius directes qPCR Mix-SYBR proporcionats pel kit poden obtenir resultats de PCR quantitatius en temps real de manera ràpida i eficaç.
5×Direct RT Mix i 2×El qPCR Mix-SYBR directe té una forta tolerància als inhibidors i el lisat de les mostres es pot utilitzar com a plantilla per a RT-qPCR directament.Aquest kit conté la transcriptasa inversa Foregene d'ARN d'alta afinitat única i la DNA polimerasa D-Taq calenta, dNTPs, MgCl2, tampó de reacció, optimitzador i estabilitzador de PCR.
Especificacions
200×20μl Rxns, 1000×20μl Rxns
Components del kit
| Part I | Tampó CL |
| Foregene Protease Plus II | |
| Tampó ST | |
| Part II | Esborrador d'ADN |
| 5 × Direct RT Mix | |
| 2 × Direct qPCR Mix-SYBR | |
| 50 × tint de referència ROX | |
| DdH2O lliure de RNasa | |
| Instruccions | |
Característiques i avantatges
■Simple i eficaç: amb la tecnologia Cell Direct RT, es poden obtenir mostres d'ARN en només 7 minuts.
■ La demanda de mostra és petita, només es poden provar 10 cel·les.
■ Alt rendiment: pot detectar ràpidament ARN en cèl·lules cultivades en plaques de 384, 96, 24, 12 i 6 pous.
■ L'esborrador d'ADN pot eliminar ràpidament els genomes alliberats, reduir en gran mesura l'impacte en els resultats experimentals posteriors.
■ El sistema optimitzat de RT i qPCR fa que la transcripció inversa RT-PCR en dos passos sigui més eficient i la PCR més específica i més resistent als inhibidors de la reacció RT-qPCR.
Aplicació del kit
Àmbit d'aplicació: cèl·lules cultivades.
- ARN alliberat per lisi de mostres: només aplicable a la plantilla RT-qPCR d'aquest kit.
- El kit es pot utilitzar per a les següents finalitats: anàlisi de l'expressió gènica, verificació de l'efecte silenciador gènic mediat per siRNA, cribratge de fàrmacs, etc.
Diagrama
Emmagatzematge i vida útil
La part I d'aquest kit s'ha d'emmagatzemar a 4 ℃;La part II s'ha d'emmagatzemar a -20 ℃.
Foregene Protease Plus II s'ha d'emmagatzemar a 4℃, no congeleu a -20 ℃.
Reactiu 2×Direct qPCR Mix-SYBR s'ha d'emmagatzemar a -20℃en la foscor;si s'utilitza amb freqüència, també es pot emmagatzemar a 4℃ per a emmagatzematge a curt termini (utilitzar-lo en un termini de 10 dies).
Principis de disseny d'imprimació de PCR en temps real
Primer i imprimació inversa
Per a la PCR en temps real, el disseny d'imprimació és molt important.Els primers estan relacionats amb l'especificitat i l'eficiència de l'amplificació per PCR i es poden dissenyar amb referència als principis següents:
Longitud d'imprimació: 18-30 bp.
Contingut de GC: 40-60%.
Valor Tm: el programari de disseny d'imprimació, com ara Primer 5, pot donar el valor Tm de la imprimació.Els valors de Tm dels cebadors aigües amunt i aigües avall haurien de ser el més propers possible.També es pot utilitzar la fórmula de càlcul Tm: Tm = 4 °C (G + C) + 2 °C (A + T).Quan es realitza la PCR, generalment es selecciona una temperatura per sota del valor Tm de l'imprimació de 5 °C com a temperatura de recuit (l'augment corresponent de la temperatura de recuit pot augmentar l'especificitat de la reacció de PCR).
Primers i productes de PCR:
La longitud del producte d'amplificació de la PCR del primer disseny és preferiblement de 100-150 pb.
S'han d'evitar tant com sigui possible les imprimacions de disseny a l'àrea estructural secundària de la plantilla.
Eviteu la formació de 2 o més bases complementàries entre els extrems 3′ dels cebadors aigües amunt i aigües avall.
La base terminal del primer 3′ no pot estar present amb 3 G o C consecutius addicionals.
Els primers en si no poden tenir estructures complementàries, en cas contrari es formarà una estructura de forquilla que afectarà l'amplificació de la PCR.
L'ATCG s'ha de distribuir de la manera més uniforme possible en la seqüència d'encebadors i s'ha d'evitar la base terminal 3′ com a T.
Apèndix 1: paquet de complements de components del kit Cell Direct RT-qPCR
1.Solució de lisi cel·lular
|
| |||
| Components del kit (sistema de lisi de 24 pous/pou) | DRT-01011-A1 | DRT-01011-A2 | |
| 100 T | 500 T | ||
| Partjo | Tampó CL | 20 ml | 100 ml |
| Foregene Protease Plus II | 400 μl | 1 ml × 2 | |
| Tampó ST | 1 ml × 2 | 10 ml | |
| PartII | Esborrador d'ADN | 400 μl | 1 ml × 2 |
2.RT Mix
|
| |
| Components del kit (sistema de reacció de 20 μl) | DRT-01011-B1 |
| 200 T | |
| 5 × Direct RT Mix | 800 μl |
| DdH lliure de RNasa2O | 1,7 ml × 2 |
|
| ||
| Components del kit (sistema de reacció de 20 μl) | DRT-01011-C1 | DRT-01011-C2 |
| 200 T | 1000 T | |
| 2 × Direct qPCR Mix-SYBR | 1 ml × 2 | 1,7 ml × 6 |
| 50 × tint de referència ROX | 40 μl | 200 μl |
| DdH lliure de RNasa2O | 1,7 ml | 10 ml |
Manuals d'instruccions:
