Sense senyals d'amplificació

1. L'ADN polimerasa Taq del kit perd la seva activitat a causa d'un emmagatzematge o caducitat incorrectes del kit.
Recomanació: Confirmeu les condicions d'emmagatzematge del kit;torneu a afegir una quantitat adequada d'ADN polimerasa Taq al sistema de PCR o compreu un nou kit de PCR en temps real per a experiments relacionats.

2.Hi ha molts inhibidors de l'ADN polimerasa Taq a la plantilla d'ADN.
Suggeriment: torneu a purificar la plantilla o reduïu la quantitat de plantilla utilitzada.

3.La concentració de Mg2+ no és adequada.
Recomanació: la concentració de Mg2+ de la barreja de PCR real 2× que oferim és de 3,5 mM.Tanmateix, per a alguns imprimadors i plantilles especials, la concentració de Mg2+ pot ser més alta.Per tant, podeu afegir directament MgCl2 per optimitzar la concentració de Mg2+.Es recomana augmentar el Mg2+ 0,5 mM cada vegada per a l'optimització.

4.Les condicions d'amplificació per PCR no són adequades i la seqüència o la concentració de l'encebador són inadequades.
Suggeriment: confirmeu la correcció de la seqüència de l'encebador i que no s'hagi degradat;si el senyal d'amplificació no és bo, intenteu reduir la temperatura de recuit i ajusteu la concentració d'imprimació adequadament.

5.La quantitat de plantilla és massa poca o massa.
Recomanació: realitzeu una dilució de gradient de linealització de plantilla i seleccioneu la concentració de plantilla amb el millor efecte de PCR per a l'experiment de PCR en temps real.

NTC té un valor de fluorescència massa alt

1.Contaminació de reactius causada durant el funcionament.
Recomanació: Substituïu-los per nous reactius per a experiments de PCR en temps real.

2. La contaminació es va produir durant la preparació del sistema de reacció PCR.
Recomanació: Prendre les mesures de protecció necessàries durant el funcionament, com ara: portar guants de làtex, utilitzar una punta de pipeta amb filtre, etc.

3.Els primers es degraden i la degradació dels primers provocarà una amplificació inespecífica.
Suggeriment: utilitzeu l'electroforesi SDS-PAGE per detectar si els primers estan degradats i substituïu-los per nous primers per a experiments de PCR en temps real.

Primer dímer o amplificació inespecífica

1.La concentració de Mg2+ no és adequada.
Recomanació: La concentració de Mg2+ de la barreja 2× Real PCR EasyTM que oferim és de 3,5 mM.Tanmateix, per a alguns imprimadors i plantilles especials, la concentració de Mg2+ pot ser més alta.Per tant, podeu afegir directament MgCl2 per optimitzar la concentració de Mg2+.Es recomana augmentar el Mg2+ 0,5 mM cada vegada per a l'optimització.

2.La temperatura de recuit de PCR és massa baixa.
Suggeriment: augmenteu la temperatura de recuit de PCR en 1 ℃ o 2 ℃ cada vegada.

3.El producte PCR és massa llarg.
Recomanació: la durada del producte de PCR en temps real ha d'estar entre 100 i 150 pb, no més de 500 pb.

4.Els primers es degraden, i la degradació dels primers donarà lloc a l'aparició d'una amplificació específica.
Suggeriment: utilitzeu l'electroforesi SDS-PAGE per detectar si els primers estan degradats i substituïu-los per nous primers per a experiments de PCR en temps real.

5.El sistema PCR és inadequat o el sistema és massa petit.
Suggeriment: el sistema de reacció de PCR és massa petit farà que la precisió de detecció disminueixi.El millor és utilitzar el sistema de reacció recomanat per l'instrument quantitatiu de PCR per tornar a executar l'experiment de PCR en temps real.

Poca repetibilitat dels valors quantitatius

1.L'instrument funciona malament.
Suggeriment: pot haver-hi errors entre cada forat de PCR de l'instrument, cosa que provoca una mala reproductibilitat durant la gestió o la detecció de la temperatura.Si us plau, comproveu segons les instruccions de l'instrument corresponent.

2. La puresa de la mostra no és bona.
Recomanació: Les mostres impures comportaran una mala reproductibilitat de l'experiment, que inclou la puresa de la plantilla i els primers.El millor és tornar a purificar la plantilla i els primers es purifiquen millor mitjançant SDS-PAGE.

3. El temps de preparació i emmagatzematge del sistema PCR és massa llarg.
Suggeriment: utilitzeu el sistema de PCR en temps real per a l'experiment de PCR immediatament després de la preparació i no el deixeu de banda durant massa temps.

4.Les condicions d'amplificació per PCR no són adequades i la seqüència o la concentració de l'encebador són inadequades.
Suggeriment: confirmeu la correcció de la seqüència de l'encebador i que no s'hagi degradat;si el senyal d'amplificació no és bo, intenteu reduir la temperatura de recuit i ajusteu la concentració d'imprimació adequadament.

5.El sistema PCR és inadequat o el sistema és massa petit.
Suggeriment: el sistema de reacció de PCR és massa petit farà que la precisió de detecció disminueixi.El millor és utilitzar el sistema de reacció recomanat per l'instrument quantitatiu de PCR per tornar a executar l'experiment de PCR en temps real.