Esterilització de puntes de pipeta i tubs EP, etc.
1. Prepareu 0,1% (una mil·lèsima) DEPC (substància altament tòxica) amb aigua desionitzada, feu-lo servir amb cura en una campana de fums i emmagatzemeu-lo a 4°C lluny de la llum;
L'aigua DEPC és aigua pura tractada amb DEPC i esterilitzada per alta temperatura i alta pressió.S'ha provat per estar lliure de RNasa, DNasa i proteïnasa.
2. Poseu la punta de la pipeta i el tub EP al 0,1% de DEPC i assegureu-vos que la punta de la pipeta i el tub EP s'omplen amb un 0,1% de DEP.
3. Protegiu de la llum, deixeu reposar durant la nit (12-24h)
4. La caixa que conté la punta i el tub EP no cal remullar amb DEPC.Després d'eliminar aproximadament l'aigua DEPC a la punta o al tub EP, empaqueta-la i embolcalla-la.
5. 121 graus centígrads, 30min
6. 180 graus centígrads, sec durant diverses hores (almenys 3 hores)
Nota: a.Utilitzeu guants i mascaretes de làtex quan manipuleu DEPC!b, o sense esterilització DEPC, 130 ℃, autoclau de 90 minuts (molts laboratoris d'esterilització a alta temperatura dues vegades)
Consideracions sobre l'extracció d'ARN
Dos fenòmens principals de fracàs d'aïllament de l'ARN dels teixits
degradació de l'ARN i residus d'impureses als teixits,Pel que fa a la degradació, mirem primer per què l'ARN extret de cèl·lules cultivades no es degrada fàcilment.Tots els reactius d'extracció d'ARN existents contenen components que inhibeixen ràpidament la RNasa.Afegiu el lisat a les cèl·lules cultivades i simplement barregeu-lo, totes les cèl·lules es poden barrejar a fons amb el lisat i les cèl·lules es lisen completament.Després de lisar les cèl·lules, els ingredients actius del lisat inhibeixen immediatament la RNasa intracel·lular, de manera que l'ARN roman intacte.És a dir, com que les cèl·lules cultivades es posen en contacte fàcilment i totalment amb el lisat, el seu ARN no es degrada fàcilment;d'altra banda, l'ARN del teixit es degrada fàcilment perquè les cèl·lules del teixit no són fàcils de contactar ràpidament amb el lisat.a causa del contacte suficient.Tan,Suposant que hi ha una manera de convertir el teixit en una sola cèl·lula mentre s'inhibeix l'activitat de l'ARN, el problema de la degradació es podria resoldre completament.
La mòlta de nitrogen líquid és el mètode més eficaç.Tanmateix, el mètode de mòlta de nitrogen líquid és molt problemàtic, especialment quan el nombre de mostres és gran.Això va donar lloc al següent millor: l'homogeneïtzador.ElhomogeneïtzadorEl mètode no considera la qüestió de com s'inhibeix l'activitat de la RNasa abans que les cèl·lules es posen en contacte amb el lisat, sinó que pretén que la taxa de interrupció del teixit sigui més ràpida que la velocitat a la qual la RNasa intracel·lular degrada RN.
L'efecte de l'homogeneïtzador elèctric és millor,i l'efecte de l'homogeneïtzador de vidre és pobre, però en general, el mètode d'homogeneïtzació no pot evitar el fenomen de degradació.Per tant, si l'extracció es degrada, s'ha d'utilitzar l'homogeneïtzador elèctric original per a la mòlta amb nitrogen líquid;l'homogeneïtzador de vidre original s'ha de canviar per un homogeneïtzador elèctric o fresar directament amb nitrogen líquid.El problema és gairebé 100% factible.es resolgui.
El problema dels residus d'impureses que afecta els experiments posteriors té causes més diverses que la degradació, i les solucions són corresponentment diferents.En conclusió,si hi ha degradació o impureses residuals al teixit, s'ha d'optimitzar el mètode/reactiu d'extracció del material experimental específic.No cal que utilitzeu les vostres precioses mostres per a l'optimització: podeu comprar al mercat alguns animals petits com peix/pollastre, agafar la part corresponent del material per a l'extracció d'ARN i l'altra part per a l'extracció de proteïnes: triturar amb extracte de boca, estómac i intestins.
L'ARN objectiu de l'ARN extret s'utilitza per a diferents experiments de seguiment i els seus requisits de qualitat són diferents
La construcció de la biblioteca d'ADNc requereix integritat de l'ARN sense residus d'inhibidors de la reacció enzimàtica;Northern requereix una major integritat de l'ARN i requisits més baixos per als residus d'inhibidors de la reacció enzimàtica;La RT-PCR no requereix una integritat d'ARN massa alta,però inhibeix les reaccions enzimàtiques.Els requisits de residus són estrictes.L'entrada determina la sortida;cada vegada que l'objectiu és obtenir l'ARN de la màxima puresa, costarà a la gent i diners.
Recollida/emmagatzematge de mostres
Factors que afecten la degradació Després que la mostra abandoni el cos viu/o l'entorn de creixement original, els enzims endògens de la mostra començaran a degradar l'ARN,i la taxa de degradació està relacionada amb el contingut d'enzims endògens i la temperatura.Tradicionalment, només hi ha dues maneres d'inhibir completament l'activitat enzimàtica endògena: afegir lisat immediatament i homogeneïtzar a fons i ràpidament;tallar a trossos petits i congelar immediatament en nitrogen líquid.Tots dos enfocaments requereixen un funcionament ràpid.El segon és apte per a totes les mostres, mentre que el primer només és apte per a teixits amb baix contingut de cèl·lules i enzims endògens i més fàcils d'homogeneïtzar.Concretament, el teixit vegetal, el fetge, el tim, el pàncrees, la melsa, el cervell, el greix, el teixit muscular, etc., es congelen millor amb nitrogen líquid abans de continuar.
Fragmentació i homogeneïtzació de mostres
Factors que afecten la degradació i el rendiment La fragmentació de la mostra ésper a una homogeneïtzació completa, que és per a l'alliberament complet i complet d'ARN.Les cèl·lules es poden homogeneïtzar directament sense trencar-se.Els teixits només es poden homogeneïtzar després de trencar-se.Els llevats i els bacteris s'han de trencar amb els enzims corresponents abans que es puguin homogeneïtzar.Els teixits amb un contingut enzimàtic endògen més baix i una homogeneïtzació més fàcil es poden triturar i homogeneïtzar alhora en el lisat mitjançant un homogeneïtzador;teixit vegetal, fetge, tim, pàncrees, melsa, cervell, greix, teixit muscular i altres mostres, o bé són rics en enzims endògens o no s'homogeneïtzen fàcilment,per tant, la ruptura i homogeneïtzació dels teixits s'han de realitzar per separat.El mètode de fragmentació més fiable i productiu és la mòlta amb nitrogen líquid, i el mètode d'homogeneïtzació més fiable és l'ús d'un homogeneïtzador elèctric.Una nota especial sobre la mòlta amb nitrogen líquid: la mostra no s'ha de descongelar durant tot el procés de mòlta, ja que és més probable que els enzims endògens funcionin quan es congelen.
Elecció de lisat
Afectant la comoditat de funcionament i els factors d'impureses endògenes residuals Les solucions de lisi d'ús habitual gairebé poden inhibir l'activitat de la RNasa.Per tant, el punt clau per triar una solució de lisi és considerar en combinació amb el mètode de purificació.Hi ha una excepció:Es recomana que les mostres amb alt contingut d'enzims endògens utilitzin un lisat que contingui fenol per augmentar la capacitat d'inactivar enzims endògens.
Elecció del mètode de purificació
Factors que afecten les impureses endògenes residuals, velocitat d'extracció Per a mostres netes com les cèl·lules, es poden obtenir resultats satisfactoris amb gairebé qualsevol mètode de purificació disponible.Però per a moltes altres mostres, especialment aquelles amb alts nivells d'impureses com plantes, fetge, bacteris, etc., escollir un mètode de purificació adequat és crucial.El mètode de purificació centrífuga de columna té una velocitat d'extracció ràpida i pot eliminar eficaçment les impureses que afecten la reacció enzimàtica posterior de l'ARN, però és car (Foregene pot oferir kits rendibles, feu clic a més detalls).aquí);L'ús de mètodes de purificació econòmics i clàssics, com ara la precipitació de LiCl, també pot obtenir resultats satisfactoris, però el temps de funcionament és llarg..
"Tres disciplines i vuit atencions" per a l'extracció d'ARN
Disciplina 1:Posar fi a la contaminació d'enzims exògens.
Nota 1:Utilitzeu estrictament mascaretes i guants.
Nota 2:Els tubs de centrífuga, els capçals de punta, les barres de pipeta, els dipòsits d'electroforesi i els bancs experimentals implicats en l'experiment s'han d'eliminar a fons.
Nota 3:Els reactius/solucions implicats en l'experiment, especialment l'aigua, han de ser lliures de RNases.
Disciplina 2:Bloqueja l'activitat dels enzims endògens
Nota 4:Trieu un mètode d'homogeneïtzació adequat.
Nota 5:Trieu un lisat adequat.
Nota 6:Controlar la quantitat inicial de la mostra.
Disciplina 3:Aclareix el teu propòsit d'extracció
Nota 7:Amb qualsevol sistema de lisat que s'acosta a la quantitat màxima inicial de mostra, la taxa d'èxit de l'extracció disminueix bruscament.
Nota 8:L'únic criteri econòmic per a l'extracció d'ARN amb èxit és l'èxit en experiments posteriors, no el rendiment.
Les 10 principals fonts de contaminació per RNasa
1. Els dits són la primera font d'enzims exògens, per la qual cosa s'han d'utilitzar i substituir els guants amb freqüència.A més, també s'han de portar mascaretes, perquè la respiració també és una font important d'enzims.Un avantatge addicional de portar una màscara de guant és protegir l'experimentador.
2. Puntes de pipeta, tubs de centrífuga, pipetes: la RNasa no es pot inactivar només amb l'esterilització, de manera que les puntes de pipeta i els tubs de centrífuga s'han de tractar amb DEPC, encara que estiguin marcats com a tractats amb DEPC.El millor és utilitzar una pipeta especial, netejar-la amb una bola de cotó al 75% d'alcohol abans d'utilitzar-la, especialment la vareta;a més, assegureu-vos de no utilitzar un extractor de caps.
3. L'aigua/tampó ha d'estar lliure de contaminació per RNasa.
4. Com a mínim, la taula de prova s'ha de netejar amb boles de cotó al 75% d'alcohol.
5.RNasa endògena Tots els teixits contenen enzims endògens, de manera que la congelació ràpida dels teixits amb nitrogen líquid és la millor manera de reduir la degradació.El mètode d'emmagatzematge / mòlta de nitrogen líquid és realment inconvenient, però és l'única manera per als teixits amb alts nivells d'enzims endògens.
6. Mostres d'ARN Els productes d'extracció d'ARN poden contenir traces de contaminació per RNasa.
7. Extracció de plasmidis L'extracció de plasmidis utilitza sovint la Rnasa per degradar l'ARN, i la Rnasa residual s'ha de digerir amb Proteinasa K i extreure's per PCI.
8. Emmagatzematge d'ARN Fins i tot si s'emmagatzema a baixa temperatura, petites quantitats de RNasa provocaran la degradació de l'ARN.La millor solució per a la conservació a llarg termini de l'ARN és una suspensió de sal/alcohol, perquè l'alcohol inhibeix tota l'activitat enzimàtica a baixes temperatures.
9. Quan els cations (Ca, Mg) contenen aquests ions, l'escalfament a 80C durant 5 minuts farà que l'ARN es clivin, de manera que si cal escalfar l'ARN, la solució de conservació ha de contenir un agent quelant (citrat de sodi 1 mM, pH 6,4).
10. Els enzims utilitzats en experiments posteriors poden estar contaminats per la RNasa.
10 consells per a l'extracció d'ARN
1: prevenir ràpidament l'activitat de la RNasa.Les mostres es congelen ràpidament després de la recollida i la RNasa s'inactiva mitjançant un funcionament ràpid durant la lisi.
2: Trieu un mètode d'extracció adequat per a teixits amb alt contingut de ribozim, i el teixit adipós és millor utilitzar el mètode que conté fenol.
3: La qualitat de predicció requereix Northern, la construcció de la biblioteca d'ADNc requereix una gran integritat i RT-PCR i RPA (assaig de protecció de la ribonucleasa) no requereixen una gran integritat.La RT-PCR requereix una puresa elevada (residus d'inhibidors enzimàtics).
4: Una homogeneïtzació completa és la clau per millorar el rendiment i reduir la degradació.
5: Comproveu la integritat de la detecció d'electroforesi d'ARN, 28S: 18S = 2:1 és un signe complet, 1:1 també és acceptable per a la majoria dels experiments.
6: Eliminació d'ADN per a RT-PCR, anàlisi de matrius El millor és utilitzar la Dnasa I per eliminar l'ADN.
7: Reduir la contaminació d'enzims exògens: els enzims no es poden importar de l'exterior.
8: Quan es concentra l'àcid nucleic de baixa concentració, s'ha d'afegir un reactiu de coprecipitació.Però per evitar que el co-precipitant que conté enzims i contaminació d'ADN.
9: Dissoleu bé l'ARN, si cal, escalfeu-lo a 65ºC durant 5 minuts.
mètode d'emmagatzematge adequat
Es pot emmagatzemar a –20C durant un temps curt, i a –80C durant molt de temps.El primer pas per millorar els rendiments d'ARN és adonar-se que el contingut d'ARN de diferents mostres varia molt.Alta abundància (2-4ug/mg) com fetge, pàncrees, cor, abundància mitjana (0,05-2ug/mg) com cervell, embrió, ronyó, pulmó, tim, ovari, baixa abundància (<0,05ug/mg) mg) com bufeta, os, greix.
1: Lisi les cèl·lules per alliberar RN: si no s'allibera l'ARN, el rendiment es reduirà.L'homogeneïtzació elèctrica funciona millor que altres mètodes d'homogeneïtzació, però també pot ser que s'hagi de combinar amb altres mètodes, com ara la puré de nitrogen líquid, la digestió enzimàtica (lisozima/liticasa)
2: Optimització del mètode d'extracció.Els problemes més importants amb els mètodes basats en fenols són l'estratificació incompleta i la pèrdua parcial d'ARN (el sobrenedant no es pot eliminar completament).L'estratificació incompleta es deu a un alt contingut d'àcids nucleics i proteïnes, que es pot resoldre augmentant la quantitat de lisat utilitzada o reduint la quantitat de mostra.Es va afegir un pas d'extracció de cloroform al teixit adipós.La pèrdua d'ARN es pot reduir mitjançant el bombament posterior o eliminant la capa orgànica seguida de la centrifugació.El problema més gran dels mètodes basats en la centrifugació de columna és l'excés de mostra.
Consells d'extracció clàssics
1. Purificació de fenols: afegiu un volum igual de fenol/cloroform 1:1 i barregeu enèrgicament durant 1-2 minuts.Centrifugar a gran velocitat durant 2 minuts.Traieu amb cura el sobrenedant (80-90%).No arribeu mai a la capa mitjana.Es pot afegir un volum igual de la solució de reacció a fenol/cloroform i eliminar el sobrenedant.Els dos sobrenedants es poden barrejar per precipitar l'àcid nucleic per millorar el rendiment.No sigueu massa suau en barrejar i no intenteu treure tot el sobrenedant.
2. Rentat amb etanol al 70-80%: durant el rentat, s'ha de suspendre l'àcid nucleic per assegurar-se que la sal residual es renta.Al mateix temps, immediatament després d'abocar l'etanol, centrifugueu a gran velocitat durant uns segons i, a continuació, elimineu l'etanol residual amb una pipeta.Dissoldre després de reposar a temperatura ambient durant 5-10 minuts.
11. Extracció d'organitzacions especials
1. Teixit fibrós: la clau per a l'extracció d'ARN del teixit fibrós com el cor/múscul esquelètic és trencar completament el teixit.Aquests teixits tenen una densitat cel·lular baixa, de manera que la quantitat d'ARN per unitat de pes de teixit és baixa, i el millor és utilitzar la màxima quantitat de partida possible.Assegureu-vos de triturar el teixit a fons en condicions de congelació.
2. Teixits amb alt contingut en proteïnes/greixos: el contingut en greixos cerebrals/vegetals és alt.Després de l'extracció de PCI, el sobrenedant conté flòculs blancs.El sobrenedant s'ha de tornar a extreure amb cloroform.
3. Teixits amb alt contingut en àcid nucleic/ribozima: la melsa/timo té un alt contingut en àcid nucleic i ribozima.La mòlta de teixit en condicions de congelació seguida d'una ràpida homogeneïtzació pot inactivar eficaçment els ribozims.Tanmateix, si el lisat és massa viscós (a causa de l'elevat contingut d'àcid nucleic), l'extracció de PCI no es podrà estratificar de manera eficaç;afegir més lisat pot resoldre aquest problema.Múltiples extraccions de PCI poden eliminar més ADN residual.Si es forma un precipitat blanc immediatament després d'afegir alcohol, indica contaminació d'ADN.La reextracció amb PCI àcid després de la dissolució pot eliminar la contaminació de l'ADN.
4. Teixit vegetal: El teixit vegetal és més complex que el teixit animal.En general, les plantes es molen en condicions de nitrogen líquid, de manera que la degradació de l'ARN per enzims endògens és poc freqüent.Si el problema de degradació no es resol, és gairebé segur que és causat per les impureses contingudes a la mostra.Les impureses que contenen moltes plantes donaran lloc a residus, i el motiu dels residus és sovint perquè aquestes impureses tenen algunes similituds amb l'ARN: tu precipites i jo precipito, i tu adsorbeixo i jo adsorbeixo.Aquestes característiques determinen que són inhibidors enzimàtics molt forts.
Actualment, els reactius d'extracció d'ARN comercials es poden adaptar a gairebé tots els teixits animals amb petits ajustaments, però hi ha pocs reactius d'extracció d'ARN comercials que poden ser adequats per a la majoria dels teixits vegetals.Afortunadament, Foregene pot oferir especialKits d'extracció d'ARN vegetal, tenimKit d'aïllament d'ARN total de plantes, Kit d'aïllament d'ARN total de plantes Plus.Aquest últim està especialment dissenyat per a plantes amb alt contingut en polisacàrids i polifenols.Per a l'extracció d'ARN, la retroalimentació dels usuaris del laboratori és especialment bona.
12. L'efecte de la congelació i descongelació de la mostra La mostra congelada pot ser més gran i cal tallar-la abans de ser utilitzada per a l'extracció d'ARN.Les mostres tendeixen a fondre's (possiblement parcialment) durant el tall.És possible que s'hagin de pesar mostres congelades abans de l'extracció de l'ARN i, definitivament, es produirà la descongelació durant aquest procés.De vegades, la descongelació de la mostra també es produeix durant el procés de mòlta de nitrogen líquid;o la mostra congelada s'afegeix directament al lisat sense mòlta de nitrogen líquid, i definitivament es produirà la descongelació abans de l'homogeneïtzació completa.Els experiments han demostrat que el teixit congelat és més propens a la degradació de l'ARN durant la descongelació que el teixit fresc.La raó probable: el procés de congelació-descongelació altera les estructures de la cèl·lula, facilitant que els enzims endògens entrin en contacte directe amb l'ARN.
13. Judici de la qualitat de l'ARN Normalment, l'electroforesi s'utilitza per jutjar la integritat de l'ARN, i A260/A280 s'utilitza per jutjar la puresa de l'ARN.En teoria, l'ARN intacte té una proporció de 28S:18S = 2,7:1, i la majoria de les dades emfatitzen la proporció de 28S:18S = 2:1.El fet és que gairebé cap dels ARN extrets de mostres que no siguin les cèl·lules es troba en una proporció de 2:1 (això es va obtenir mitjançant l'Agilent Bioanalyzer).
Els resultats de l'electroforesi de l'ARN es veuen afectats per molts factors, com ara l'estructura secundària, les condicions d'electroforesi, la càrrega de la mostra, el grau de saturació per EB, etc. Utilitzeu l'electroforesi nativa per detectar l'ARN i utilitzeu el marcador d'ADN com a control.Si el 28S a 2 kb i el 18S a 0,9 kb són clars i 28S: 18S > 1, la integritat pot complir els requisits de la majoria dels experiments posteriors.
A260/A280 és un indicador que ha provocat molta confusió.En primer lloc, cal aclarir el significat original d'aquest indicador per als àcids nucleics: ARN pur, el seu A260/280 = aproximadament 2,0.L'ARN pur és la "causa" i A260/A280 = 2 és l'"efecte".Ara tothom està utilitzant A260/A280 com a "causa", pensant que "si A260/A280 = 2, aleshores l'ARN és pur", cosa que naturalment porta a confusió.
Si esteu interessats, podeu afegir una mica de reactiu que s'utilitza sovint en l'extracció, com ara fenol, isotiocianat de guanidina, PEG, etc., a la vostra mostra d'ARN, i després mesurar la relació A260/A280.La realitat és que molts dels reactius utilitzats per a l'extracció d'ARN, així com moltes impureses de la mostra, absorbeixen al voltant de A260 i A280, afectant A260/A280.
L'enfocament més instructiu actualment és escanejar mostres d'ARN en el rang de 200-300 nm.La corba de l'ARN pur té les següents característiques: la corba és llisa, A230 i A260 són dos punts d'inflexió, A300 és a prop de 0, A260/A280 = al voltant de 2,0 i A260/A230 = al voltant de 2,0.Si les dades d'escaneig no estan disponibles, també s'ha de determinar la relació A260/A230, ja que aquesta relació és més sensible al transport de totes les impureses que afecten la reacció enzimàtica.Tingueu en compte el rang lineal del dispositiu (0,1-0,5 per a A260).
Hi ha altres dos fenòmens útils: la relació serà aproximadament un 0,3 menor quan es mesura A260/A280 en aigua;mentre que la proporció mesurada en EDTA 10 mM és aproximadament 0,2 superior a la mesurada en EDTA 1 mM.
Productes relacionats:
Fabricant i proveïdor de kits d'aïllament d'ARN total de plantes de la Xina |Foregene (foreivd.com)
Sèrie d'aïllament d'ARN - Foregene Co., Ltd. (foreivd.com)
Hora de publicació: 15-jul-2022
