Kit de detecció d'àcids nucleics Escherichia coli O157:H7 (mètode de sonda fluorescent PCR)
Descripció del kit:
Cat.No.FP102
S'utilitza per a la detecció ràpida i la detecció d'E. coli O157:H7 en mostres d'aliments, pinsos, aigua i mostres ambientals.
Descripcions
S'utilitza per a la detecció i el cribratge ràpids d'E. coli O157:H7 en mostres d'aliments, pinsos, aigua i mostres ambientals.
[Principi de prova]Segons el principi de la tecnologia de PCR fluorescent, els cebadors específics i les sondes Taqman estan dissenyats per al gen específic d'Escherichia coli O157: H7 i es detecten mitjançant un instrument de PCR fluorescent, per tal de realitzar la detecció d'Escherichia coli O157: H7 Detecció qualitativa d'ADN.
Contingut del kit
Nota: la sonda del canal ROX no està inclosa.
| Coponents | Especificació | Qunitat |
| Buffer A | Tub | 1 |
| Buffer B | Tub | 1 |
| Control positiu | Tub | 1 |
| Control negatiu | Tub | 1 |
Ús esperat
S'utilitza per detecció ràpida i detecció d'E. coli O157:H7 en mostres d'aliments, pinsos, aigua i mostres ambientals.
Condicions d'emmagatzematge i data de caducitat
Emmagatzemeu a -20 ℃ a la foscor i eviteu la congelació i descongelació repetida.
El període de validesa és de 12mesos i la data de producció es mostra a l'embalatge exterior.
Instruments i consumibles
Instrument de PCR quantitatiu fluorescent, pistola de pipetes i puntes coincidents, agitador de vòrtex, mini centrífuga.
Ús
1. Processament de mostres
1.1 Tipus de mostra: aquest kit és adequat per a mostres d'aliments, pinsos, aigua i altres mostres sospitoses d'estar contaminades per Escherichia coli O157:H7.Per als productes carnis processats en profunditat, begudes i altres substàncies que contenen pigments, s'han d'esbandir per evitar afectar la recollida del senyal de fluorescència.
1.2 Processament de mostres: consulteu "GB 4789.10-2016 Food Safety National Standard Food Microbioological Examination of Escherichia coli O157: H7 Test" per a la preparació de mostres, cultiu d'enriquiment i aïllament d'Escherichia coli O157: H7.
- Nextracció d'àcid ucleic
Agafeu 20 ml de solució d'enriquiment en un tub de centrífuga d'1,5 ml, afegiu 200 μL de lisat microbià (es requereix un kit addicional), agitar durant 30 segons, centrifugueu breument i reserveu.
Observacions: l'extracció de l'àcid nucleic del lisat s'ha de completar en 10 minuts i no es pot emmagatzemar durant molt de temps.
3. Amplificació d'àcids nucleics
3.1 Enceneu l'instrument de PCR quantitatiu fluorescent per utilitzar-lo.
Tampó A i tampó B del kit, foneu-los a fons i centrifugueu breument.Afegiu 18 μl de tampó A i 2 μl de tampó B a cada tub de reacció de PCR.A continuació, afegiu 5 ml de control negatiu, àcid nucleic extret i control positiu als tubs de reacció de PCR, tapeu els tubs i centrifugueu breument.
3.3 Transferiu el tub de reacció de PCR a una màquina de PCR fluorescent i utilitzeu els procediments següents per realitzar experiments d'amplificació: seleccioneu 25 ml per al sistema de reacció, recolliu senyals de fluorescència a 60 °C per a cada cicle i seleccioneu FAM per al canal de detecció.
| Pas | Programa | Nombre de cicles |
| 1 | 37 ℃ 5 minuts | 1 |
| 2 | 9 5 ℃ 3 min | 1 |
| 3 | 95°C 15 s | 40 |
| 60 ℃ 30 s (recollir fluorescència) |
Guies per a l'anàlisi de problemes
The following is an analysis of the problems that might be encountered in the extraction of viral RNA. We wish it would be helpful to your experiment. In addition, for other experimental or technical problems other than operating instructions and problem analysis, we have dedicated technical support to help you. Contact us if you need at : 028-83361257or E-mail：Tech@foregene.com。
No es pot extreure ARN o el rendiment d'àcid nucleic és baix
Normalment hi ha molts factors que afecten l'eficiència de la recuperació, com ara: el contingut d'ARN de la mostra, el mètode d'operació, el volum d'elució, etc.。
Anàlisi de causes comunes:
1. Bany de gel o centrifugació a baixa temperatura (4 ° C) durant el funcionament.
Suggeriment: Funcionament a temperatura ambient (15-25 °C), mai amb bany de gel i centrífuga a baixa temperatura.
2. Emmagatzematge inadequat de mostres o emmagatzematge de mostres durant massa temps.
Suggeriment: Emmagatzemeu les mostres a -80 ° C o congeleu-les en nitrogen líquid i eviteu l'ús repetit de congelació-descongelació;intenteu utilitzar mostres acabades de recollir per a l'extracció d'ARN.
3.Lisi insuficient de la mostra
Recomanació: assegureu-vos que la mostra i la solució de treball (acrilamida lineal) s'han barrejat a fons i s'han incubat durant 10 minuts a temperatura ambient (15-25 ° C)
4. L'eluent s'ha afegit incorrectament
Recomanació: assegureu-vos que s'afegeix ddH2O lliure de RNasa al centre de la membrana de la columna de purificació
5.Volum incorrecte d'etanol anhidre al tampó viRW2
Suggeriment: seguiu les instruccions, afegiu el volum correcte d'etanol anhidre a Buffer viRW2 i barregeu-los bé abans d'utilitzar el kit.
6. Ús incorrecte de la mostra.
Suggeriment: 200µl de mostra per 500µl de Buffer viRL.Un volum de mostra excessiu donarà lloc a una taxa d'extracció d'ARN reduïda.
7.Volum d'elució incorrecte o elució incompleta.
Suggeriment: el volum d'eluent de la columna de purificació és de 30-50μl;si l'efecte d'elució no és satisfactori, es recomana afegir ddH sense RNasa preescalfat2O i allargar el temps posant-lo a temperatura ambient, com ara 5-10min
8.La columna de purificació té residus d'etanol després d'esbandir el tampó viRW2.
Suggeriment: si l'etanol encara queda després d'esbandir el buffer viRW2 i la centrifugació del tub buit durant 2 minuts, la columna de purificació es pot deixar a temperatura ambient durant 5 minuts després de la centrifugació del tub buit per eliminar completament l'etanol restant.
La degradació de les molècules d'ARN purificades
La qualitat de l'ARN purificat està relacionada amb factors com ara l'emmagatzematge de mostres, la contaminació de la RNasa i el funcionament.
Anàlisi de causes comunes:
1. Les mostres recollides no es van guardar a temps.
Suggeriment: si la mostra no s'utilitza a temps després de la recollida, si us plau, emmagatzemeu-la a -80 ℃ o nitrogen líquid immediatament.Per a l'extracció de molècules d'ARN, intenteu utilitzar mostres acabades de recollir sempre que sigui possible.
2.Les mostres recollides es van congelar i descongelar repetidament.
Suggeriment: Eviteu la congelació i descongelació repetida (no més d'una vegada) durant la recollida i l'emmagatzematge de mostres, en cas contrari el rendiment d'àcid nucleic disminuirà.
3.La RNasa es va introduir al quiròfan o no es van utilitzar guants d'un sol ús, mascaretes, etc.
Suggeriment: l'experiment d'extracció de molècules d'ARN es realitza millor en una sala d'operacions d'ARN separada i la taula experimental es neteja abans de l'experiment.Utilitzeu guants i màscares d'un sol ús durant l'experiment per evitar la degradació de l'ARN causada per la introducció de la RNasa.
4.El reactiu està contaminat per RNasa durant l'ús.
Suggeriment: substituïu-lo per un nou kit d'aïllament d'ARN viral per a experiments relacionats.
5.La contaminació amb RNasa dels tubs de centrífuga, puntes de pipeta, etc. Suggeriment: Assegureu-vos que els tubs de centrífuga, puntes de pipeta i pipetes estiguin lliures de RNases.
Les molècules d'ARN purificades van afectar els experiments aigües avall
Les molècules d'ARN purificades per la columna de purificació afectaran els experiments aigües avall si hi ha massa ions de sal o proteïnes, com ara: transcripció inversa, Northern Blot, etc.。
1. Hi ha ions de sal restants a les molècules d'ARN eluïts.
Recomanació: assegureu-vos que s'ha afegit el volum correcte d'etanol anhidre al tampó viRW2 i renteu la columna de purificació dues vegades segons la velocitat de centrifugació correcta a les instruccions d'operació; si encara queden ions de sal, podeu afegir el tampó viRW2 a la columna de purificació i deixar-lo a temperatura ambient durant 5 minuts.A continuació, realitzeu la centrifugació per eliminar la contaminació dels ions de sal en la màxima mesura
2. Hi ha etanol restant a les molècules d'ARN eluïts
Suggeriment: un cop confirmat que les columnes de purificació han estat esbandides amb Buffer viRW2, realitzeu una centrifugació en tub buit segons la velocitat centrífuga de les instruccions d'operació.Si encara queda etanol, es pot deixar durant 5 minuts a temperatura ambient després d'una centrifugació en tub buit per eliminar l'etanol restant al màxim.
Manuals d'instruccions:
Manual d'instruccions del kit d'aïllament d'ARN viral
