És ben sabut que en el dogma central, l'ARN és el mediador transcripcional entre l'expressió de l'ADN i la proteïna.En comparació amb la detecció d'ADN, la detecció d'ARN pot reflectir de manera més objectiva l'expressió gènica en els organismes.Els experiments amb ARN inclouen: qRT-PCR, RNA-Seq i detecció de gens de fusió, etc. Basant-se en les característiques del propi ARN (l'anell de sucre de l'ARN té un grup hidroxil lliure més que l'anell de sucre de l'ADN), juntament amb un gran nombre de RNases a l'entorn, l'ARN és més inestable i més fàcil de degradar que l'ADN.Escombraries entrant, escombraries fora, si la qualitat de l'ARN no és bona, els resultats experimentals han de ser insatisfactoris, manifestant-se específicament com a dades inexactes o poca repetibilitat.Per tant, s'ha de prestar més atenció al processament de l'ARN, i l'enllaç del control de qualitat també és més important per garantir la precisió i l'exactitud de les dades experimentals posteriors.

Per al control de qualitat de l'ARN, generalment hi ha els següents mètodes d'ús habitual:

• Espectrofotometria
• electroforesi en gel d'agarosa
• Bioanalitzador Agilent
• PCR quantitativa fluorescent en temps real
• Mètode de tint fluorescent Qubit

01 Espectrofotometria

L'ARN té dobles enllaços conjugats i té un pic d'absorció a una longitud d'ona de 260 nm.Segons la llei de Lambert-Beer, podem calcular la concentració d'ARN a partir del pic d'absorció a 260 nm.A més, també podem calcular la puresa de l'ARN segons la proporció de pics d'absorció de 260 nm, 280 nm i 230 nm.280 nm i 230 nm són els pics d'absorció de proteïnes i molècules petites, respectivament.La proporció d'A260/A280 i A260/A230 de puresa d'ARN qualificada hauria de ser superior a 2. Si és inferior a 2, vol dir que hi ha contaminació per proteïnes o molècules petites a la mostra d'ARN i s'ha de purificar de nou.Les fonts de contaminació afectaran els experiments aigües avall, com ara inhibir l'eficiència d'amplificació de les reaccions de PCR, donant lloc a resultats quantitatius inexactes.La puresa de l'ARN té una gran influència en els resultats posteriors, de manera que l'espectrofotometria és generalment un enllaç de control de qualitat indispensable en el primer pas dels experiments d'àcid nucleic.

Figura 1. Espectre d'absorció d'ARN/ADN típic

02 Electroforesi en gel d'agarosa

A més de la puresa, la integritat de l'ARN també és un dels indicadors importants per jutjar la qualitat de l'ARN.La degradació de l'ARN donarà lloc a un gran nombre de fragments curts a la mostra, de manera que es reduirà el nombre de fragments d'ARN que es poden detectar i cobrir eficaçment per la seqüència de referència.La integritat de l'ARN es pot comprovar mitjançant electroforesi de l'ARN total en un gel d'agarosa a l'1%.Aquest mètode pot configurar el gel vostè mateix o utilitzar el sistema prefabricat E-Gel™ per a proves d'integritat.Més del 80% de l'ARN total és ARN ribosòmic, la majoria del qual està compost per ARNr 28S i 18S (en sistemes de mamífers).L'ARN de bona qualitat mostrarà dues barres brillants evidents, que són barres brillants de 28S i 18S, respectivament, a 5 Kb i 2 Kb, i la proporció tendirà a ser propera a 2:1.Si es troba en un estat difús, vol dir que la mostra d'ARN pot haver estat degradada, i es recomana utilitzar el mètode descrit més endavant per provar més la qualitat de l'ARN.

Figura 2. Comparació de l'ARN degradat (carril 2) i intacte (carril 3) a l'electroforesi en gel d'agarosa

03 Bioanalitzador Agilent

A més del mètode d'electroforesi en gel d'agarosa descrit anteriorment, que ens pot ajudar a identificar la integritat de l'ARN de manera senzilla i ràpida, també podem utilitzar el bioanalitzador Agilent per determinar la integritat de l'ARN.Utilitza una combinació de microfluídica, electroforesi capil·lar i fluorescència per avaluar la concentració i la integritat de l'ARN.Mitjançant l'ús de l'algoritme integrat per analitzar el perfil de la mostra d'ARN, el bioanalitzador Agilent pot calcular un valor d'integritat de l'ARN de referència, el número d'integritat de l'ARN (en endavant, RIN) [1].Com més gran sigui el valor de RIN, més gran serà la integritat de l'ARN (1 està molt degradat, 10 és el més complet).Alguns experiments amb ARN suggereixen utilitzar RIN com a paràmetre per a l'avaluació de la qualitat.Prenent com a exemple els experiments de seqüenciació d'alt rendiment (en endavant, NGS), les directrius del repertori immunitari humà d'Oncomine™, que s'utilitzen per detectar receptors d'antigen de cèl·lules B i T a la sèrie de panells Oncomine de Thermo Fisher, suggereixen que es poden mesurar mostres amb valors de RIN superiors a 4, es poden mesurar lectures i clons més efectius (Figura 3).Hi ha diferents intervals recomanats per a diferents panells, i sovint un RIN més alt pot aportar dades més efectives.

A la figura 3, als experiments del repertori immunitari humà Oncomine™, les mostres amb RIN superior a 4 poden detectar lectures i clons de cèl·lules T més efectives.【2】

Tanmateix, el valor RIN també té algunes limitacions.Tot i que RIN té una alta correlació amb la qualitat de les dades experimentals de NGS, no és adequat per a mostres FFPE.Les mostres de FFPE han estat tractades químicament durant molt de temps i l'ARN extret generalment té un valor de RIN relativament baix.Tanmateix, això no vol dir que les dades efectives de l'experiment hagin de ser insatisfactòries.Per avaluar amb precisió la qualitat de les mostres de FFPE, hem d'utilitzar mesures diferents del RIN.A més del RIN, el bioanalitzador Agilent també pot calcular el valor DV200 com a paràmetre d'avaluació de la qualitat de l'ARN.DV200 és un paràmetre que calcula la proporció de fragments de més de 200 pb en una mostra d'ARN.DV200 és un millor indicador de la qualitat de la mostra FFPE que RIN.Per a l'ARN extret per FFPE, té una correlació molt alta amb el nombre de gens que es poden detectar eficaçment i la diversitat de gens [3].Tot i que DV200 pot compensar les deficiències en la detecció de qualitat de FFPE, el bioanalitzador Agilent encara no pot analitzar exhaustivament els problemes de qualitat de les mostres d'ARN, inclòs si hi ha inhibidors a les mostres.Els mateixos inhibidors poden afectar l'eficiència d'amplificació dels experiments aigües avall i reduir la quantitat de dades útils.Per saber si hi ha un inhibidor a la mostra, podem adoptar el mètode de PCR quantitatiu fluorescent en temps real que es descriu a continuació.

04 PCR quantitativa fluorescent en temps real

El mètode PCR quantitatiu fluorescent en temps real no només pot detectar els inhibidors de la mostra, sinó que també reflecteix amb precisió la qualitat de l'ARN a la mostra FFPE.En comparació amb els analitzadors biològics Agilent, els instruments quantitatius de fluorescència en temps real són més populars als principals laboratoris biològics a causa de la seva aplicació més àmplia.Per provar la qualitat de les mostres d'ARN, només necessitem comprar o preparar sondes d'imprimació per a gens de referència interns, com ara GUSB (núm. cat. Hs00939627).Mitjançant l'ús d'aquest conjunt d'encebadors, sondes i estàndards (ARN total de concentració coneguda) per dur a terme experiments quantitatius absoluts, la concentració efectiva del fragment d'ARN es pot calcular com a estàndard d'avaluació de la qualitat de l'ARN (Quantificació d'ARN funcional (FRQ) per abreujar).En una prova NGS, vam trobar que el FRQ de les mostres d'ARN té una correlació molt alta amb el volum de dades efectiu.Per a totes les mostres superiors a 0,2 ng/uL FRQ, almenys el 70% de les lectures poden cobrir efectivament la seqüència de referència (figura 4).

A la figura 4, el valor de FRQ detectat pel mètode quantitatiu de fluorescència té una correlació molt alta (R2>0, 9) amb les dades efectives obtingudes en l'experiment NGS.La línia vermella és el valor FRQ igual a 0,2 ng/uL (log10 = -0,7).【4】

A més de ser aplicable a mostres FFPE, el mètode de PCR quantitativa en temps real també pot controlar de manera eficaç els inhibidors de les mostres.Podem afegir la mostra a detectar al sistema de reacció amb control positiu intern (IPC) i el seu assaig, i després realitzar la quantificació de fluorescència per obtenir el valor Ct.Si el valor de Ct es queda per darrere del valor de Ct en la reacció sense mostra, indica que l'inhibidor està present a la mostra i inhibeix l'eficiència d'amplificació de la reacció.

05 Mètode de tint fluorescent Qubit

El fluoròmetre Qubit és el petit dispositiu més utilitzat per a la detecció de concentració i puresa d'àcids nucleics, que és fàcil d'utilitzar i existeix a gairebé tots els laboratoris de biologia molecular.Calcula amb precisió la concentració d'àcid nucleic mitjançant la detecció i el colorant fluorescent d'unió a l'àcid nucleic (reactiu de detecció Qubit).Qubit té una alta sensibilitat i especificitat, i pot quantificar amb precisió l'ARN fins a una concentració de pg/µL.A més de la coneguda capacitat de quantificar amb precisió la concentració d'àcid nucleic, l'últim model nou de Thermo Fisher, Qubit 4.0, també pot detectar la integritat de l'ARN.El sistema de detecció d'ARN de Qubit 4.0 (assaig d'ARN IQ) detecta la integritat de l'ARN detectant simultàniament dos colorants fluorescents específics.Aquests dos colorants fluorescents es poden unir a fragments grans i petits fragments d'ARN, respectivament.Aquests dos colorants fluorescents indiquen la proporció de grans fragments d'ARN a la mostra, i a partir d'això es pot calcular el valor de QI (Integritat i Qualitat) que representa la qualitat de l'ARN.El valor d'IQ és aplicable tant a mostres FFPE com a no FFPE, i té una gran influència en la qualitat de la seqüenciació posterior.Prenent com a exemple els experiments NGS, en els experiments de prova RNA-Seq realitzats a la plataforma Ion torrent ™, la majoria de mostres amb valors de coeficient intel·lectual superiors a 4 tenien almenys un 50% de lectures efectives (figura 5).En comparació amb els mètodes de detecció esmentats anteriorment, l'assaig Qubit IQ no només és més còmode d'operar i triga menys temps (en cinc minuts), sinó que també té una gran correlació entre el valor de QI del paràmetre mesurat i la qualitat de les dades dels experiments aigües avall.

A la figura 5, hi ha una gran correlació entre el valor de Qubit RNA IQ i les lectures mapejades d'ARN-Seq.【5】

A través de la introducció anterior, crec que tothom té una comprensió suficient dels diferents mètodes de control de qualitat de l'ARN.A la pràctica, pots triarel mètode corresponent segons el tipus de mostra i els instruments existents.Només controlant bé la qualitat de l'ARN podem evitar el fracàs dels experiments posteriors causat per la mala qualitat de la mostra, estalviant així un temps, energia i costos preciosos.

Productes de referència:

Kit d'aïllament d'ARN total animal

Kit d'aïllament d'ARN total de cèl·lules

referències

【1】Schroeder, A., Mueller, O., Stocker, S. et al.El RIN: un número d'integritat de l'ARN per assignar valors d'integritat a les mesures d'ARN.BMC Molecular Biol 7, 3 (2006).https:// doi .org/10.1186/1471-21 99-7-3

【2】Guia d'usuari del repertori immunitari humà d'Oncomine (núm. de publicació MAN0017438 Rev. C.0).

【3】Leah C Wehmas, Charles E Wood, Brian N Chorley, Carole L Yauk, Gail M Nelson, Susan D Hester, Enhanced Quality Metrics for Assessing RNA Derived From Archival Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Tissue Samples, Toxicological Sciences, Volum 170, Número d'agost, Núm.https://doi.org/10.1093/toxsci/