Hem estat fabricant experimentat.Guanyar la majoria en les certificacions crucials del seu mercat per a la Xina de gran descompte d'alta sensibilitat One-Step Probe Rt-QpcrKit V2, la qualitat és la vida de la fàbrica, centrar-se en la demanda del client és la font de la supervivència i el desenvolupament de l'empresa, ens adherim a l'honestedat i l'actitud de treball de bona fe, esperant la vostra vinguda!
Hem estat fabricant experimentat.Guanyar la majoria en les certificacions crucials del seu mercat perXina Taq DNA polimerasa, Qpcr, La nostra empresa promet: preus raonables, temps de producció curt i servei postvenda satisfactori, també us donem la benvinguda a visitar la nostra fàbrica en qualsevol moment que vulgueu.Tant de bo ara tinguem un negoci agradable i a llarg termini junts!!!

Descripcions

Aquest kit utilitza un sistema de tampó de lisi únic que pot alliberar ràpidament l'ARN de les mostres de cèl·lules cultivades per a reaccions RT-qPCR, eliminant així el procés de purificació d'ARN laboriós i que requereix molt de temps.La plantilla d'ARN es pot obtenir en només 7 minuts.Els reactius 5×Direct RT Mix i 2×Direct qPCR Mix-SYBR proporcionats pel kit poden obtenir resultats de PCR quantitatius en temps real de manera ràpida i eficaç.

5×Direct RT Mix i 2×Direct qPCR Mix-SYBR tenen una forta tolerància als inhibidors, i el lisat de les mostres es pot utilitzar com a plantilla per a RT-qPCR directament.Aquest kit conté la transcriptasa inversa Foregene d'ARN d'alta afinitat única i la DNA polimerasa D-Taq calenta, dNTPs, MgCl₂, tampó de reacció, optimitzador i estabilitzador de PCR.

Especificacions

200×20μl Rxns, 1000×20μl Rxns

Components del kit

Característiques i avantatges

■ Simple i eficaç: amb la tecnologia Cell Direct RT, es poden obtenir mostres d'ARN en només 7 minuts.

■ La demanda de mostra és petita, només es poden provar 10 cel·les.

■ Alt rendiment: pot detectar ràpidament ARN en cèl·lules cultivades en plaques de 384, 96, 24, 12 i 6 pous.

■ L'esborrador d'ADN pot eliminar ràpidament els genomes alliberats, reduir en gran mesura l'impacte en els resultats experimentals posteriors.

■ El sistema optimitzat de RT i qPCR fa que la transcripció inversa RT-PCR en dos passos sigui més eficient i la PCR més específica i més resistent als inhibidors de la reacció RT-qPCR.

Aplicació del kit

Àmbit d'aplicació: cèl·lules cultivades.

- ARN alliberat per lisi de mostres: només aplicable a la plantilla RT-qPCR d'aquest kit.

- El kit es pot utilitzar per a les següents finalitats: anàlisi de l'expressió gènica, verificació de l'efecte silenciador gènic mediat per siRNA, cribratge de fàrmacs, etc.

Diagrama

Emmagatzematge i vida útil

La part I d'aquest kit s'ha d'emmagatzemar a 4 ℃;La part II s'ha d'emmagatzemar a -20 ℃.

Foregene Protease Plus II s'ha d'emmagatzemar a 4 ℃, no congelar a -20 ℃.

El reactiu 2×Direct qPCR Mix-SYBR s'ha d'emmagatzemar a -20 ℃ a la foscor;si s'utilitza amb freqüència, també es pot emmagatzemar a 4 ℃ per a un emmagatzematge a curt termini (utilitzar-lo en un termini de 10 dies). Hem estat fabricant experimentat.Aconseguint la majoria de les certificacions crucials del seu mercat per a un gran descompte a la Xina, el kit Rt-Qpcr d'un sol pas d'alta sensibilitat V2, la qualitat és la vida de la fàbrica, l'enfocament en la demanda del client és la font de la supervivència i el desenvolupament de l'empresa, ens adherim a l'honestedat i l'actitud de treball de bona fe, esperem la vostra vinguda!
Gran descompteXina Taq DNA polimerasa, Qpcr, La nostra empresa promet: preus raonables, temps de producció curt i servei postvenda satisfactori, també us donem la benvinguda a visitar la nostra fàbrica en qualsevol moment que vulgueu.Tant de bo ara tinguem un negoci agradable i a llarg termini junts!!!

QuickEasyTM Cell Direct RT-qPCR Kit -Taqman

Cat.Núm.DRT-01021/01022

Per a RT-qPCR directa cel·lular utilitzant ≤ 1000.000 cèl·lules

Presentació del producte

Aquest producte utilitza un sistema de tampó de lisi únic per alliberar ràpidament l'ARN de les mostres de cèl·lules cultivades per a reaccions RT-qPCR, eliminant el procés de purificació d'ARN laboriós i que requereix temps i només 7 minuts per obtenir la plantilla d'ARN necessària, amb la 5 × Direct RT Mix, 2 × Direct qPCR Mix-Taqman proporcionada pel kit pot obtenir resultats de PCR en temps real de manera quantitativa i ràpida.

5 × Direct RT Mix i 2 × Direct qPCR Mix-Taqman tenen una forta tolerància als inhibidors i poden realitzar una inversió eficient i una amplificació específica utilitzant el lisat de la mostra que es mesurarà com a plantilla.El reactiu conté Foregene Reverse Transcriptase, Hot D-Taq DNA Polymerase, dNTPs, MgCl₂, Reaction Buffer, PCR Optimizer and Stabilizer, que es pot utilitzar amb el tampó de lisi per detectar mostres de manera ràpida i senzilla, i té les característiques d'alta sensibilitat, especificitat i estabilitat.

Característiques del producte

Tecnologia Cell Direct RT senzilla i eficaç que triga tan sols 7 minuts a obtenir mostres d'ARN.

Els requisits de mostra són petits i es poden utilitzar un mínim de 10 cèl·lules cultivades per a l'experimentació.

Alt rendiment per a l'adquisició ràpida d'ARN de cèl·lules cultivades com ara plaques de 384, 96, 24, 12 i 6 pous.

DNA Eraser és capaç d'eliminar ràpidament els genomes alliberats, reduint molt l'impacte en els resultats experimentals posteriors.

Els sistemes optimitzats de RT i qPCR permeten una RT-PCR en dos passos amb una transcripció inversa més eficient, una especificitat i una tolerància més forta a l'inhibidor de la reacció RT-qPCR.

Aplicació del kit

Àmbit d'aplicació: Cèl·lules cultivades.

ARN interpretat per lisi de mostres: s'utilitza només com a plantilla RT-qPCR de dos passos.

Els kits es poden utilitzar per a les finalitats següents: anàlisi de l'expressió reguladora gènica, proves d'al·lels, cribratge de fàrmacs, etc.

Limitacions del kit

Fragments amplificats ≤ 300 pb.

Els kits s'utilitzen per cultivar cèl·lules recentment.

Control de qualitat del producte

Segons el sistema de gestió de la qualitat total de FOREGENE, cada lot de kits de la sèrie Cell Direct RT-qPCR es prova rigorosament diverses vegades per garantir la fiabilitat i l'estabilitat de la qualitat de cada lot de kits.

Contingut del kit

*:La lisi cel·lular, 5 × Direct RT Mix, 2 × Direct qPCR Mix-Taqman es poden comprar per separat; els detalls es proporcionen a l'Apèndix 1 (PÀGINA 13).

Condicions d'emmagatzematge

1. Condicions d'enviament

Tot el procés de transport de la caixa de gel a baixa temperatura, per assegurar-se que el kit estigui en un estat <4 °C.

2. Condicions d'emmagatzematge

Emmagatzemeu la part I a 4 °C i la part II a -20 °C.

El Foregene Protease Plus II s'ha d'emmagatzemar a 4 °C, no congelar a -20 °C.

El reactiu 2× Direct qPCR Mix-Taqman s'emmagatzema a -20 °C, o a 4 °C per a un ús a curt termini si s'utilitza amb freqüència (en un termini de 10 dies).

Informació dels components del kit

Buffer CL: proporciona l'entorn necessari per a les reaccions de lisi cel·lular.

Tampó ST: Termina la substància activa del lisat per evitar efectes en la RT posterior.

DNA Eraser: eliminador d'ADN, l'efecte d'eliminar el genoma en experiments posteriors.

5 × Direct RT Mix: conté una alta afinitat d'ARN Foregene Reverse Transcriptase, RNase Inhibitor, dNTPs, estabilitzadors, potenciadors, optimitzadors i primers de transcripció inversa per a una alineació òptima (Random Primer, Oligo(dT)₁₈Primer).

Foregene Protease Plus II: en el context del tampó de lisi, les cèl·lules es lisen per alliberar àcids nucleics.

2 × qPCR directe Mix-Taqman: aquest reactiu conté DNA polimerasa D-Taq calenta, dNTPs, MgCl₂, tampó de reacció, optimitzador de PCR i estabilitzador.

Colorant de referència 20 × ROX: s'utilitza generalment en instruments d'amplificació de PCR en temps real d'ABI, Stratagene i altres empreses, s'utilitza per ajustar la diferència entre tubs i tubs de PCR causats per errors de dosificació de PCR.La concentració de colorant de referència ROX de 20 × necessària per a diferents instruments és diferent i l'usuari pot afegir-la segons la concentració recomanada de l'instrument.

DdH lliure de RNasa₂O: Aigua ultra pura esterilitzada sense RNases per a reaccions RT-qPCR en dos passos.

Precaucions:(Assegureu-vos de llegir atentament les precaucions abans d'utilitzar el kit)

Preste atenció al mètode de funcionament de l'experiment per evitar la contaminació creuada entre mostres.

Preste atenció a la neteja de l'entorn experimental i dels estris per evitar la contaminació de la RNasa i la degradació de l'ARN.

Preneu mostres de cèl·lules fresques o ben conservades i no utilitzeu mai mostres de cèl·lules congelades i descongelades repetides.

5 × Direct qPCR Mix, 2 × Direct qPCR Mix-Taqman hauria d'evitar la congelació-descongelació repetida, en cas contrari afectarà la transcripció inversa i l'eficiència de la PCR.

Preparacionsabansfuncionament

Assegureu-vos de llegir atentament les instruccions abans d'utilitzar aquest kit.El kit Cell Direct RT-qPCR és senzill, còmode i ràpid d'operar, i les instruccions proporcionen informació completa sobre tot el kit i com utilitzar-lo correctament.Si us plau, prepareu els materials i equips experimentals necessaris abans d'utilitzar-los.

Materials i equips experimentals

◆ Cultiu de cèl·lules.

◆ 1,5 ml o 2 ml, tub de centrífuga sense RNasa/DNasa, punta sense RNasa/DNasa, tub qPCR estèril de 0,2 ml.

◆ màquina qPCR, pipeta, centrífuga de taula (≥13.400×g) (segons necessitats experimentals), etc.

Seguretat

◆ Aquest producte només té finalitats d'investigació científica, si us plau, no l'utilitzeu amb finalitats farmacèutiques, clíniques, alimentaries i cosmètiques.

◆ Quan utilitzeu productes químics, feu servir roba de laboratori, guants, ulleres de protecció, etc.

Funcionamentguies

Els sistemes de lisi cel·lular, els sistemes RT i els paquets de suplements de solució de reacció qPCR es poden comprar per separat, per obtenir més informació a l'Apèndix 1 (PÀGINA 13).

Guia de funcionament

A: Alliberament d'ARN de mostra

1. Les cèl·lules es van tractar prèviament: rentar la placa de cultiu cel·lular amb PBS fred, després lisar les cèl·lules (10-10⁶), 10⁶ que la quantitat de cèl·lules, es recomana Foregene the Cell an ARN Isolation Kit the Total (DE-03111) o Animal Total RNA Isolation Kit (DE-03011) per a l'extracció i purificació d'ARN.

1.1.Cèl·lules adherents (placa de 24 pous com a exemple)

1.1.1.Determineu el nombre de cel·les a cada pou, determineu que el nombre de cel·les és 1 × 10⁵, i utilitzeu una pipeta per treure el medi de cultiu del plat de cultiu.

1.1.2.Afegiu 200 μl de 1 × PBS prerefrigerat a cada pou.No pipeteu repetidament i traieu el PBS dels pous.Inclineu la placa i traieu tant PBS com sigui possible.Passeu al pas 2.

1.1.3.Es va afegir un plat de cultiu cel·lular diferent o una taula de números de referència 1-1 en un plat de cultiu cel·lular 1 × PBS prerefridat per al rentat cel·lular.

Taula 1-1: dosificació de PBS per a diferents nombres de cèl·lules

Nota：Per assegurar una adherència ferma de les cèl·lules,un gran nombre de pèrdua de cèl·lules evitades durant el rentat.

1.2.Cèl·lules en suspensió o cèl·lules adherides cultivades en plaques no poroses

1.2.1.Les cèl·lules adherents cultivades en plaques no multipous (les cèl·lules de suspensió comencen a partir del següent pas 1.2.2), recullen i separen les cèl·lules segons el mètode normal de recollida de cèl·lules i col·loqueu-les en una placa de cultiu o un tub de centrífuga;si s'utilitza la tripsinització, cal centrifugar per recollir les cèl·lules i eliminar la tripsina residual, afegir cèl·lules resuspeses de PBS a cèl·lules individuals per dispersar les cèl·lules.

1.2.2.Després del nombre de cèl·lules comptades, les cèl·lules alíquotes 1 × 10⁵ un per centrifugar els tubs, recollir les cèl·lules per centrifugació a 1000 × g durant 10 min.

1.2.3.Afegiu 200 μl de PBS al tub de la centrífuga, no pipeteu repetidament i aspireu directament el PBS.aneu al pas 2. (Si és difícil de precipitar i les cèl·lules es van tornar a suspendre, es pot realitzar una centrifugació de 1000 × g 10 min després de descartar el sobrenedant, el pellet cel·lular procediu al pas 2)

2.Lisi cel·lular: Traieu el tampó CL, la seva temperatura equilibrada a temperatura ambient, DNA Eraser i Foregene Protease Plus II, segons la taula següent 1-2 sistema de lisi preparat: (La solució de lisi està llesta per al seu ús).

Taula 1-2: escot preparació del sistema (Nota: a la preparació sobre gel)

3. (Placa de 24 pous com a exemple) Pipeteu 200 μl de barreja mestra de lisi cel·lular a cada pou, bufeu repetidament 5-10 vegades, incubeu a temperatura ambient (20-25 ℃) durant 5 min.

Nota：Per evitar la formació de bombolles, si us plau, quan l'escala de pipeta es va ajustar a 200 μl o menys.Les cèl·lules poden aparèixer ennuvolades després de la lisi, cosa que és normal.

4. (Placa de 24 pous com a exemple) s'afegeix al líquid 20 μl de Buffer ST (diferents sistemes de lisi Buffer ST afegit en una quantitat que es mostra a la Taula 1-3), pipetant repetit 5-10 vegades, a temperatura ambient (20-25 ℃) es van incubar durant 2 min.

Nota：La punta de la pipeta es va disposar per sota de la superfície, assegurant que es va afegir el lisat,per evitar la formació de bombolles, si us plau, quan l'escala de pipeta es va ajustar a 200 μl o menys.

Taula 1-3：Afegeix buffer ST

5.El lisat s'utilitza per a experiments posteriors de RT-qPCR.Si els experiments posteriors no es poden realitzar a temps, si us plau, mantingueu-lo en gel durant no més de 2 hores i emmagatzemeu-lo a -20 ℃ o -80 ℃ (no més de tres mesos).

B: Preparació del sistema RT

1. Traieu 5 × Direct RT Mix i col·loqueu-lo en un bany de gel, deixeu-lo fondre de manera natural i barregeu-lo suaument per al seu ús posterior;traieu ddH2O lliure de RNasa i foneu-lo i col·loqueu-lo en un bany de gel per al seu ús posterior.Prepareu el sistema de reacció sobre gel segons la taula 2-1 següent.

Taula 2-1: Preparació del sistema de reacció RT

2.Un cop finalitzada la formulació del sistema, barrejar suaument i centrifugar breument a la taula següent 2-2 condicions de reacció RT reacció.

Taula 2-2: Configuració de les condicions de reacció RT

3.Un cop finalitzada la reacció, el producte de reacció es va col·locar directament sobre gel per a qPCR, poseu la conservació a llarg termini -20 ℃ o -80 ℃.

Nota: a causa de l'ús de plantilla no purificada, poden aparèixer precipitats blancs al producte de transcripció inversa.Aquest és un fenomen normal.Centrifugueu el sobrenedant immediatament per a experiments posteriors.

La solució de reacció RT resultant s'afegeix als sistemes de reacció de PCR en temps real del següent pas, es recomana afegir quantitats que oscil·len entre el 10 i el 30% del sistema de reacció.

C: Preparació del sistema de reacció qPCR

1. La quantitat adequada de B preparada a la plantilla d'ADNc del pas segons la taula següent 3-1 per preparar un sistema de reacció.

Nota: la quantitat de plantilla d'ADNc representa el 10-30% del sistema qPCR.Per exemple, en un sistema qPCR de 20 μl, afegiu 2-6 μl de tampó de lisi, però no més de 6 μl.

2. L'optimització de bones condicions de qPCR (temperatura de recuit, etc.) per a la reacció de qPCR (les condicions de reacció que es donen a la taula 3-2).

Nota: Intenteu utilitzar condicions optimitzades per a les reaccions de qPCR per obtenir millors resultats.

Taula 3-1: Preparació del sistema de reacció PCR

1*: La concentració d'imprimació es pot ajustar en el rang de 50-900 nM quan el rendiment de la reacció de l'imprimació és deficient.

Nota: el sistema qPCR es pot ajustar segons les necessitats experimentals i el model de ciclador de fluorescència.Per a qPCR en un 50μl sistema, ajusteu la dosi del reactiu proporcionalment segons el 20μl sistema.

2*: Seleccioneu la concentració final adequada de colorant de referència ROX segons el termociclador quantitatiu de fluorescència.Les concentracions de colorant de referència ROX més adequades per als cicladors quantitatius de fluorescència comuns es mostren a la taula següent:

Taula 3-2: es proporcionen les condicions de la reacció qPCR

Nota: per obtenir el millor efecte qPCR, es pot utilitzar la PCR de gradient per optimitzar les condicions de reacció per a diferents plantilles i diferents imprimadors.Les condicions de reacció de PCR varien en funció de l'analitzador de fluorescència, plantilla, imprimació, etc. En l'operació específica, les condicions de reacció òptimes s'han de dissenyar segons les condicions específiques del termociclador quantitatiu de fluorescència, tipus de plantilla, mida del fragment d'interès, seqüència de bases del fragment amplificat i contingut de GC i durada dels primers, inclosa la temperatura de recuit, el temps de reacció, etc.

Principis de disseny d'imprimació de PCR en temps real

Primer i imprimació inversa

Per a la PCR en temps real, el disseny d'imprimació és molt important.Els primers estan relacionats amb l'especificitat i l'eficiència de l'amplificació per PCR i es poden dissenyar amb referència als principis següents:

◆ Longitud de la imprimació: 18-30 pb.

◆ Contingut de GC: 40-60%.

◆ Valor Tm: el programari de disseny d'imprimació, com ara Primer 5, pot donar el valor Tm de la imprimació.Els valors de Tm dels cebadors aigües amunt i aigües avall haurien de ser el més propers possible.També es pot utilitzar la fórmula de càlcul Tm: Tm = 4 °C (G + C) + 2 °C (A + T).Quan es realitza la PCR, generalment es selecciona una temperatura per sota del valor Tm de l'imprimació de 5 °C com a temperatura de recuit (l'augment corresponent de la temperatura de recuit pot augmentar l'especificitat de la reacció de PCR).

◆ Primers i productes de PCR:

◆ La longitud del producte d'amplificació de la PCR del primer disseny és preferiblement de 100-150 pb.

◆ S'han d'evitar tant com sigui possible les imprimacions de disseny a l'àrea estructural secundària de la plantilla.

◆ Evitar la formació de 2 o més bases complementàries entre els extrems 3′ dels cebadors aigües amunt i aigües avall.

◆ La base terminal del primer 3′ no pot estar present amb 3 G o C consecutius addicionals.

◆ Els primers en si no poden tenir estructures complementàries, en cas contrari es formarà una estructura de forquilla que afectarà l'amplificació per PCR.

◆ L'ATCG s'ha de distribuir de la manera més uniforme possible en la seqüència d'encebadors i s'ha d'evitar la base terminal 3′ com a T.

Apèndix1：Cell DirectRT-qPCR Kit de componentspaquet de suplements t

1. Solució de lisi cel·lular