Especificitat de la detecció
En la majoria dels casos, el propòsit del disseny d'imprimació és maximitzar l'especificitat de la PCR.Això ve determinat per la influència més o menys previsible de moltes variables.Una variable important és la seqüència a l'extrem 3' de l'encebador.
És important destacar que els assajos de PCR dissenyats per a l'especificitat tenen més probabilitats de mantenir una alta eficiència en un ampli rang dinàmic, perquè l'assaig no produeix productes d'amplificació inespecífics, competint així amb els reactius de PCR o inhibint la reacció principal d'amplificació.
Per descomptat, en alguns casos, l'especificitat no és el més important, per exemple, quan l'objectiu és quantificar patògens estretament relacionats però diferents, calen estàndards especials de disseny, optimització i verificació.
La corba de fusió és un mètode estàndard per avaluar l'especificitat dels amplicons, almenys pel que fa a si s'ha d'amplificar un únic objectiu.Tanmateix, cal subratllar que les corbes de fusió poden ser enganyoses perquè, per exemple, es poden veure afectades pels efectes combinats d'imprimadors subòptims i concentracions baixes de plantilla.
P5 |La corba de fusió mostra els desplaçaments de Tm obtinguts a partir de dues deteccions de quantitats diferents de dos ADN diana.
A. A concentracions més altes (ad)), no hi ha cap dímer d'imprimació evident després de completar la mesura de qPCR.A mesura que la concentració de la plantilla disminueix a 50 còpies (e), comença a aparèixer un producte inespecífic i es converteix en l'únic producte amb la concentració més baixa (f).
B. La prova va registrar les mateixes Tms a totes les concentracions objectiu, i no hi havia cap dímer d'imprimació evident fins i tot a la concentració més baixa (5 còpies).Quan s'utilitzen aquests dos mètodes de detecció, no es van detectar productes d'amplificació als NTC.
P5 mostra les corbes de dissolució obtingudes amb mostres en les quals la plantilla està present a diferents concentracions.P 5a mostra que a les dues concentracions més baixes, les Tms dels productes d'amplificació inespecífics produïts són inferiors a les dels amplicons específics.
Òbviament, aquest mètode de detecció no es pot utilitzar de manera fiable per detectar objectius que existeixen en concentracions baixes.
Curiosament, els NTC, és a dir, mostres sense ADN en absolut, no van registrar productes d'amplificació (no específics), cosa que indica que l'ADN genòmic de fons pot participar en l'amplificació/polimerització no específica.
De vegades, aquests primers de fons i amplificació inespecífica no es poden solucionar, però sovint és possible dissenyar un mètode de detecció que no tingui amplificació inespecífica en cap concentració de plantilla i NTC (P 5b).
Aquí, fins i tot registrar l'amplificació de la concentració objectiu amb un Cq de 35 produirà una corba de dissolució específica.De la mateixa manera, els NTC no van mostrar signes d'amplificació inespecífica.De vegades, el comportament de detecció pot dependre del licor mare i només es detecta una amplificació inespecífica en determinades composicions de tampó, que poden estar relacionades amb diferents concentracions de Mg2+.
Estabilitat de detecció
L'optimització de Ta és un pas útil en el procés de verificació i optimització empírica de la detecció de qPCR.Proporciona una indicació directa de la robustesa del conjunt d'imprimació mostrant la temperatura (o rang de temperatura) que produeix el Cq més baix sense amplificar el NTC.
És possible que la diferència de sensibilitat de dues a quatre vegades no sigui important per a persones amb una alta expressió d'ARNm, però per a les proves de diagnòstic, pot significar la diferència entre resultats positius i falsos negatius.
Les propietats Ta dels primers qPCR poden variar molt.Algunes proves no són molt robustes, i si no es realitzen sota el valor òptim de Ta dels primers, col·lapsaran ràpidament.
Això és important perquè aquest tipus de detecció sovint és problemàtic al món real i la puresa de la mostra, la concentració d'ADN o la presència d'un altre ADN poden no ser òptimes.
A més, el nombre de còpia objectiu pot variar en un ampli rang, i els reactius, els estris de plàstic o els instruments poden ser diferents dels utilitzats en configurar la prova.
P6|El gradient de temperatura mostra la diferent robustesa de la detecció per PCR.
A. Utilitzeu la mescla mestra Sensifast SYBR de Bioline (número de catàleg BIO-98050) per realitzar PCR sobre ADNc preparat a partir d'ARN del cervell humà.
B. Utilitzeu l'instrument CFX qPCR de Bio-Rad per registrar el mapa d'amplificació i la corba de dissolució de l'apalè (NM_033207, F: GCCATGGAGGAAAGTGACAGACC, R: CTCATGTGTGGGTGATCTCCTAGG).
C. Gràfic d'amplificació i corba de fusió d'ACSBG1 (NM_015162.4, F: CTACACTTCCGGCACCACTGG, R: GTCCACGTGATATTGTCTTGACTCAG).
D. Gràfic d'amplificació i corba de dissolució de GFAP (NM_002055.5, F: TGGAGAGGAAGATTGAGTCGCTGG, R: CGAACCTCCTCCTCGTGGATCTTC).
E. Cqs registrats a diferents temperatures de recuit, mostrant la diferència de Cq registrada sota un gradient de temperatura de 7C.
P 6 mostra un resultat típic d'una prova indesitjable, on es va realitzar qPCR mitjançant un gradient Tas entre 59C i 67C (P 6a), utilitzant primers per a tres gens específics del cervell humà.
Es pot veure a partir del gràfic d'amplificació que els cebadors d'Opalin estan lluny de ser ideals perquè el seu rang de Ta òptim és molt estret (figura 6b), és a dir, els Cqs estan àmpliament dispersos, cosa que fa que els Cqs es comparen significativament amb els seus Cqs òptims Baix.
Aquest mètode de detecció és inestable i pot conduir a una amplificació subòptima.Per tant, aquest parell de primers s'hauria de redissenyar.A més, l'anàlisi de la corba de fusió (insert) mostra que l'especificitat d'aquest mètode de detecció també pot ser problemàtica, perquè la corba de fusió de cada Ta és diferent.
El mètode de detecció ACSBG1 que es mostra a P 6c és més robust que el mètode de detecció Opalin anterior, però encara està lluny de ser ideal i és probable que es pugui millorar.
Tanmateix, destaquem que no hi ha cap connexió necessària entre robustesa i especificitat, perquè la corba de dissolució produïda per aquest mètode de detecció mostra el mateix valor màxim en totes les Tas (insert).
D'altra banda, la prova de robustesa és molt més tolerant, produint Cqs similars en una àmplia gamma de Tas, com en la prova GFAP mostrada a P 6d.
La diferència de Cqs obtinguda en el mateix rang de 8 graus Celsius és inferior a 1, i la corba de dissolució (insert) confirma les característiques de detecció en aquest rang de temperatura.Val la pena assenyalar que la Tas calculada i l'interval de Ta real poden ser molt diferents.
Hi ha moltes directrius dissenyades per ajudar els investigadors a dissenyar imprimacions eficients, la majoria de les quals es basen en regles establertes des de fa temps i s'ha prestat molta atenció a l'extrem 3 de les imprimacions.Sovint es recomana incloure una G o C a l'extrem 3' i dues bases G o C (pinça GC), però no més de dues de les 5 últimes bases.
A la pràctica, aquestes regles poden guiar els investigadors, però no són necessàriament correctes en totes les circumstàncies.
P7 |L'extrem 3' de la imprimació té poc efecte sobre l'especificitat o l'eficiència.
A. La posició dels primers per al gen humà HIF-1α (NM_181054.2).
B. Utilitzeu el licor mare Agilent Brilliant III SYBR Green (núm. cat. 600882) per amplificar sis ítems de prova.
C. Gràfic d'amplificació i corba de fusió registrada per l'instrument CFX qPCR de Bio-Rad i cebadors de 3′ extrems.Els NTC es mostren en vermell.
D. Registre Cqs de cada ítem de prova
Per exemple, el resultat a P 7 contradiu la regla del 3′extrem.Tots els dissenys produeixen bàsicament els mateixos resultats, amb només dues combinacions d'imprimadors que condueixen a una amplificació inespecífica en NTC.
Tanmateix, no podem donar suport a l'efecte del clip GC, perquè en aquest cas, utilitzar A o T com a màxim de 30 bases no redueix l'especificitat.
La prova C, on el cebador F acaba en GGCC, va registrar Cqs en NTC, cosa que indica que es podria voler evitar aquestes seqüències a l'extrem 30.Destaquem que l'única manera de determinar la millor seqüència d'extrem 3' d'un parell d'imprimadors és avaluar experimentalment alguns cebadors candidats.
Eficiència d'amplificació
És important destacar que, tot i que la detecció de PCR inespecífica mai no pot arribar a ser específica, l'eficiència de l'amplificació es pot ajustar i maximitzar de moltes maneres diferents canviant l'enzim, el licor mare, els additius i les condicions de cicle.
Per avaluar l'eficiència de la detecció de PCR, el millor és utilitzar una dilució en sèrie de 10 o 5 vegades l'àcid nucleic objectiu, és a dir, el "mètode de la corba estàndard".
Si s'utilitzen amplicons de PCR o dianes d'ADN sintètics per generar una corba estàndard, les dilucions en sèrie d'aquestes dianes s'han de barrejar amb una quantitat constant d'ADN de fons (com ara l'ADN genòmic).
P8 |Corba de dilució per avaluar l'eficiència de la PCR.
A. Utilitzeu primers per a HIF-1: F: AAGAACTTTTAGGCCGCTCA i R: TGTCCTGTGGTGACTTGTCC i Agilent's Brilliant III SYBR Green mastermix (número de catàleg 600882) per a PCR i condicions de corba de fusió.
B. Es van transcriure 100 ng d'ARN, es van diluir 2 vegades i es van diluir mostres d'ADNc diluïdes en sèrie 5 vegades a 1 ng d'ADN genòmic humà.La corba de fusió es mostra al requadre.
C. La reacció RT, la dilució i la dilució en sèrie es van repetir per a la segona mostra d'ADNc i els resultats van ser similars.
P 8 mostra dues corbes estàndard, utilitzant el mateix mètode de detecció en dues mostres d'ADNc diferents, el resultat és la mateixa eficiència, al voltant del 100%, i el valor R2 també és similar, és a dir, el grau d'ajust entre les dades experimentals i la línia de regressió o les dades Grau de linealitat.
Les dues corbes estàndard són comparables, però no exactament iguals.Si el propòsit és quantificar amb precisió l'objectiu, cal tenir en compte que és inacceptable proporcionar un càlcul del número de còpies sense explicar la incertesa.
P9 |Incertesa de mesura associada a la quantificació mitjançant una corba estàndard.
A. Utilitzeu imprimadors per a GAPDH (NM_002046) per dur a terme la PCR i les condicions de la corba de fusió.F: ACAGTTGCCATGTAGACC i R: TAACTGGTTGAGCACAGG i Mastermix Sensifast SYBR de Bioline (número de catàleg BIO-98050).
B. Gràfic d'amplificació, corba de fusió i corba estàndard registrada amb l'instrument CFX qPCR de Bio-Rad.
C. Gràfic de corba estàndard i interval de confiança (IC) del 95%.
D. El nombre de còpies i l'interval de confiança del 95% dels tres valors de Cq derivats de la corba de dilució.
P 9 mostra que per a una prova optimitzada, la variabilitat inherent d'una sola corba estàndard és aproximadament 2 vegades (interval de confiança del 95%, de mínim a màxim), que pot ser la variabilitat més petita que es pot esperar.
Producte relacionat:
Kit de PCR directe de teixit animal
Hora de publicació: 30-set-2021
