L'experiment RT-qPCR inclou l'extracció d'ARN i l'avaluació de la qualitat, la transcripció inversa i la qPCR tres passos, cada pas té moltes precaucions, les presentarem amb detall a continuació.

Ⅰ.Avaluació de la qualitat de l'ARN

En l'experiment RT-qPCR, un cop finalitzada l'extracció d'ARN, s'ha d'avaluar la qualitat de l'ARN i l'experiment de seguiment només es pot dur a terme després de qualificar-lo.Els mètodes d'avaluació inclouen l'espectrofotòmetre, l'electroforesi en gel Agilent, l'anàlisi Agilent 2100, entre els quals l'espectrofotòmetre més utilitzat i el mètode de detecció d'electroforesi en gel d'agarosa.Cal tenir en compte que aquests dos mètodes s'han d'utilitzar conjuntament per completar la detecció i l'anàlisi de la concentració, la puresa i la integritat de l'ARN, per tal de garantir la qualitat de l'ARN.

Kit d'aïllament d'ARN relacionat: 

Kit d'aïllament d'ARN total de cèl·lules

Es pot obtenir ARN total altament purificat i d'alta qualitat a partir de diverses cèl·lules cultivades en 11 minuts.

Kit d'aïllament d'ARN total animal

Extraieu de manera ràpida i eficient ARN total d'alta puresa i alta qualitat de diversos teixits animals.

Espectrofotòmetre:

L'espectrofotòmetre s'utilitza principalment per determinar la concentració i la puresa de l'ARN, però no pot detectar la integritat de l'ARN i els residus genòmics.Entre ells, A260/280 i A260/230 són paràmetres importants per a la detecció de la puresa de l'ARN, i la puresa de l'ARN es pot detectar segons la fluctuació dels seus valors:

1. 1,9< A260/280< 2,1, indicant que la puresa de l'ARN és bona;A260/280<1,9, que indica que pot haver-hi residus de proteïnes a l'ARN;A260/280>2.1, que indica una possible degradació parcial de l'ARN, que es pot confirmar encara més mitjançant electroforesi en gel d'agarosa.

2. 2.0< A260/230< 2.2, indicant que la puresa de l'ARN és bona;A260/230< 2,0, que indica que hi pot haver residus de reactius orgànics a l'ARN, com ara fenols, etanol o sucres.

Electroforesi en gel d'agarosa:

L'assaig d'electroforesi en gel d'agarosa pot analitzar la integritat de l'ARN, el genoma i els residus de proteïnes, però no pot quantificar amb precisió la concentració d'ARN ni detectar els residus de reactius orgànics.Preneu, per exemple, les plantilles d'ARN eucariotes:

1. L'ARN es va sotmetre a electroforesi en gel d'agarosa.Si només hi havia tres bandes individuals de 28sRNA, 18sRNA i 5.8sRNA al mapa del gel, indica que l'ARN extret està intacte.Si hi ha un fenomen d'arrossegament, indica una degradació parcial de l'ARN.

2. Si hi ha una única banda brillant entre el forat de la cola i la banda de 28sRNA, pot haver-hi residus d'ADN genòmic.

3. Si apareixen bandes al forat de la cola, indica que hi pot haver residus de proteïnes i altres substàncies macromoleculars.

Ⅱ. Transcripció inversa

Un cop finalitzada l'extracció de l'ARN, s'ha de revertir en ADNc per a experiments posteriors, de manera que el pas de reversió és essencial.La transcripció inversa s'introduirà a partir de la selecció de la transcriptasa inversa i el cebador:

Selecció de la transcriptasa inversa:

Les transcriptases inverses típiques inclouen AMV RTasa i MMLV RTasa.La RNasa H de l'AMV RTase té una activitat forta, una llargada de síntesi curta, una quantitat de síntesi baixa i una bona estabilitat tèrmica (42 ~ 55 ℃).L'activitat de la RNasa H de la MMLV RTase és feble, la longitud de la síntesi és llarga, la quantitat de síntesi és alta i l'estabilitat tèrmica és deficient (37 ~ 42 ℃).

Com que l'enzim RNasa H té la funció de degradar la plantilla d'ARN, s'hauria de seleccionar preferentment MMLV amb una activitat RNasa H feble durant la transcripció inversa, i després d'una enginyeria genètica posterior, l'estabilitat tèrmica de MMLV ha assolit un salt qualitatiu.Prenent ForegeneTranscriptasa inversa Foreasy (M-MLV per a transcripció inversa) com a exemple, és una nova transcriptasa inversa expressada en bacteris modificats per E. coli mitjançant tecnologia de recombinació genètica.És una ADN polimerasa recombinant que sintetitza una cadena d'ADN complementària a partir d'ARN monocatenari, ADN o un híbrid ARN:ADN.No té activitat RNasa H, una forta estabilitat, una forta afinitat per l'ARN i una alta sensibilitat de detecció.

 

Transcriptasa inversa Foreasy (M-MLV per a transcripció inversa)

Selecció de la imprimació:

Generalment, els cebadors RT es divideixen en tres categories: oligo dT, cebadors aleatoris i cebadors específics de gens.Seleccioneu primers adequats per al seu ús segons diferents requisits experimentals.

1. Si la plantilla és d'origen eucariota i l'ADNc tardà s'utilitza per a l'amplificació de PCR de rutina, es recomana Oligo (dT);Si l'experiment posterior només s'utilitza per a qPCR, es recomana barrejar Oligo (dT) amb cebadors aleatoris per millorar l'eficiència de la transcripció inversa.

2. Si la plantilla és de procariotes, s'han de seleccionar cebadors aleatoris o cebadors específics de gens per a la transcripció inversa.

Ⅲ.qPCR

La quantificació de fluorescència s'elabora principalment a partir de la selecció de mètodes quantitatius, principis de disseny d'imprimació, selecció de ROX, configuració del sistema de reacció i establiment de condicions de reacció, etc.

Selecció de mètodes quantitatius:

Els mètodes quantitatius es divideixen en mètodes quantitatius relatius i mètodes quantitatius absoluts.La quantificació relativa es pot utilitzar per detectar l'efecte de certs mètodes de tractament sobre l'expressió gènica, detectar la diferència d'expressió gènica en diferents moments i comparar la diferència d'expressió gènica en diferents teixits.La quantificació absoluta pot detectar la quantitat d'àcid nucleic del virus i així successivament.Quan fem experiments, hem de triar els mètodes quantitatius adequats segons els nostres propis experiments.

Principis de disseny inicial:

El disseny del primer per a qPCR està directament relacionat amb l'eficiència de l'amplificació i l'especificitat del producte.Per tant, dissenyar correctament bons primers és el primer pas d'una qPCR amb èxit.En el disseny d'imprimació, s'ha de prestar atenció als principis següents quan es compleix el principi del disseny d'imprimació convencional:

1. La longitud del fragment diana es controla entre 100 i 300 pb;

2. Disseny d'exons creuats per evitar la influència de l'ADN genòmic;

3. Els primers dissenyats s'han de provar per a l'eficiència d'amplificació, i només quan l'eficiència d'amplificació arriba a l'estàndard (90-110%) es poden utilitzar per a experiments quantitatius;

4. La concentració d'imprimació sol optimitzar-se entre 0,1 uM i 1,0 uM.

Selecció deROX:

En el procés de reacció quantitativa, ROX pot ajustar la diferència del camí òptic, l'error de pipeta o la diferència de volum causada per l'evaporació i la condensació de manera uniforme, millorant la repetibilitat dels resultats.Tanmateix, cal tenir en compte que la selecció de ROX està relacionada amb l'instrument.Si l'instrument qPCR té la funció de corregir automàticament la diferència entre forats, no cal afegir ROX;en cas contrari, cal afegir una correcció ROX.Els petits socis en la compra de reactius han de ser segons l'instrument utilitzat per triar el ROX correcte, evitar errors posteriors.

Preparació del sistema de reacció:

Es prefereixen volums de reacció de 20 ul i 50 ul.Quan es formula el sistema s'ha de prestar atenció als aspectes següents:

1. El sistema de reacció s'ha de preparar mitjançant ventilació al banc de treball ultra net, nou ddH₂O s'utilitza per a cada experiment;

2. Cada experiment ha de preparar NTC per verificar si hi ha contaminació al sistema, i cada parell de primers ha de fer NTC quan es prepara el sistema;

3. Per detectar si hi ha residus d'ADNg a la plantilla d'ARN, es pot preparar NRT per a cada mostra per a la detecció;

4. En preparar el sistema, es recomana fer almenys 3 repeticions tècniques per a una mostra;

5. Quan la plantilla és ADNc, es recomana diluir 5-10 vegades per reduir l'efecte inhibidor del sistema de transcripció inversa en l'experiment de qPCR.És millor explorar la quantitat de plantilla per gradient, de manera que el valor CT cau entre 20-30;

6. Determineu el nombre de reaccions requerides, augmenteu un 5-10% en funció del nombre de reaccions i calculeu el nombre de configuració del volum;

7, el sistema es prepara utilitzant el principi de premescla, barrejant després de la centrifugació i assegurar-se que no hi hagi bombolles;

8, En la mesura del possible, triar consumibles de suport.

Kit RT-qPCR relacionat