RT-qPCR es desenvolupa a partir de la tecnologia PCR ordinària.Afegeix productes químics fluorescents (tints fluorescents o sondes fluorescents) al sistema de reacció de PCR tradicional, i detecta el procés de recuit i extensió de la PCR en temps real segons els seus diferents mecanismes luminescents.Els canvis de senyal fluorescent en el medi s'utilitzen per calcular la quantitat de canvi de producte en cada cicle de PCR.Actualment, els mètodes més comuns són el mètode de tint fluorescent i el mètode de sonda.

Mètode de tint fluorescent:
Alguns colorants fluorescents, com ara SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO, etc., no emeten llum per si mateixos, però emeten fluorescència després d'unir-se al solc menor de dsDNA.Per tant, al començament de la reacció de PCR, la màquina no pot detectar el senyal fluorescent.Quan la reacció passa a l'extensió de recuit (mètode de dos passos) o a l'etapa d'extensió (mètode de tres passos), les cadenes dobles s'obren en aquest moment i la nova ADN polimerasa Durant la síntesi de cadena, les molècules fluorescents es combinen al solc menor dsDNA i emeten fluorescència.A mesura que augmenta el nombre de cicles de PCR, més i més colorants es combinen amb dsDNA i el senyal fluorescent també es millora contínuament.Preneu SYBR Green Ⅰ com a exemple.
Mètode de sonda:
La sonda Taqman és la sonda d'hidròlisi més utilitzada.Hi ha un grup fluorescent a l'extrem 5' de la sonda, generalment FAM.La sonda en si és una seqüència complementària del gen objectiu.Hi ha un grup d'extinció fluorescent a l'extrem 3' del fluoròfor.D'acord amb el principi de transferència d'energia de ressonància de fluorescència (Förster resonance energy transfer, FRET), quan el grup fluorescent reporter (molècula fluorescent donant) i el grup fluorescent extintor (molècula fluorescent receptora) Quan l'espectre d'excitació se solapa i la distància és molt propera (7-10 nm), l'excitació de la molècula de fluorescència del donant pot induir la molècula de fluorescència donant està debilitat.Per tant, al començament de la reacció de PCR, quan la sonda estigui lliure i intacta al sistema, el grup fluorescent informador no emetrà fluorescència.En recuit, l'imprimació i la sonda s'uneixen a la plantilla.Durant l'etapa d'extensió, la polimerasa sintetitza contínuament noves cadenes.L'ADN polimerasa té activitat exonucleasa 5′-3′.En arribar a la sonda, l'ADN polimerasa hidrolitzarà la sonda de la plantilla, separarà el grup fluorescent informador del grup fluorescent extintor i alliberarà el senyal fluorescent.Com que hi ha una relació un a un entre la sonda i la plantilla, el mètode de la sonda és superior al mètode del colorant pel que fa a la precisió i la sensibilitat de la prova.

Fig 1 Principi de qRT-PCR

Disseny d'imprimació
Principis:

Els cebadors s'han de dissenyar a la regió conservada de la sèrie d'àcids nucleics i tenir especificitat.

El millor és utilitzar la seqüència d'ADNc, i la seqüència d'ARNm també és acceptable.Si no, esbrineu el disseny de la regió cds de la seqüència d'ADN.
La longitud del producte quantitatiu fluorescent és de 80-150 pb, la més llarga és de 300 pb, la longitud de l'imprimació generalment és d'entre 17-25 bases i la diferència entre els imprimadors aigües amunt i aigües avall no hauria de ser massa gran.

El contingut de G+C està entre el 40% i el 60%, i el 45-55% és el millor.
El valor TM està entre 58 i 62 graus.
Intenteu evitar els dímers d'imprimació i els autodímers, (no apareixen més de 4 parells de bases complementàries consecutives) estructura de forquilla, si és inevitable, feu ΔG<4,5 kJ/mol* Si no podeu assegurar-vos que l'ADNg s'ha eliminat durant la transcripció inversa Neteja, el millor és dissenyar els imprimadors de l'intró *extrem 3′ per evitar que no es puguin modificar l'estructura AT, T-GC/C i rics, 3) primers i no
específic L'homologia de la seqüència amplificada heterogènia és preferiblement inferior al 70% o té 8 homologia de bases complementàries.
Base de dades:
CottonFGD cerca per paraules clau
Disseny d'imprimació:
Disseny d'imprimació IDT-qPCR

Fig2 Pàgina de l'eina de disseny d'imprimació en línia d'IDT

Visualització de la pàgina de resultats de la Fig3
Disseny de primers lncRNA:
lncRNA:els mateixos passos que l'ARNm.
miRNA:El principi del mètode stem-loop: atès que tots els miRNA són seqüències curtes d'uns 23 nt, no es pot realitzar la detecció directa de PCR, per la qual cosa s'utilitza l'eina de seqüència stem-loop.La seqüència tija-bucle és un ADN monocatenari d'uns 50 nt, que pot formar una estructura de forquilla per si mateix.3 "L'extrem es pot dissenyar com una seqüència complementària al fragment parcial de miRNA, llavors el miRNA objectiu es pot connectar a la seqüència de bucle de tija durant la transcripció inversa i la longitud total pot arribar als 70 pb, que està en línia amb la longitud del producte amplificat determinada per qPCR.Disseny d'imprimació de miRNA de cua.
Detecció específica de l'amplificació:
Base de dades d'explosió en línia: explosió de CottonFGD per similitud de seqüències
Explosió local: consulteu l'ús de Blast+ per fer explosió local, linux i macos poden establir directament una base de dades local, el sistema win10 també es pot fer després d'instal·lar ubuntu bash.Crea una base de dades d'explosió local i una explosió local;obre ubuntu bash a win10.
Avís: el cotó de muntanya i el cotó de les illes marines són cultius tetraploides, de manera que el resultat de l'explosió sovint serà de dos o més partits.En el passat, l'ús de CD NAU com a base de dades per realitzar explosió és probable que trobis dos gens homòlegs amb només unes poques diferències SNP.Normalment, els dos gens homòlegs no es poden separar pel disseny d'imprimació, de manera que es tracten com el mateix.Si hi ha un indel evident, l'imprimació normalment es dissenya a l'indel, però això pot conduir a l'estructura secundària de l'imprimació L'energia lliure augmenta, provocant una disminució de l'eficiència d'amplificació, però això és inevitable.

Detecció de l'estructura secundària del primer:
Passos:obre oligo 7 → introdueix la seqüència de plantilla → tanca la subfinestra → desa → localitza l'imprimació a la plantilla, premeu Ctrl+D per establir la longitud de la imprimació → analitzeu diverses estructures secundàries, com ara el cos d'autodimerització, l'heterodímer, la forquilla, el desajust, etc. Les dues últimes imatges de la figura 4 són els resultats de la prova dels primers.El resultat de l'imprimació frontal és bo, no hi ha una estructura de dímer i forquilla evident, no hi ha bases complementàries contínues i el valor absolut de l'energia lliure és inferior a 4,5, mentre que l'imprimació posterior mostra contínues Les 6 bases són complementàries i l'energia lliure és de 8,8;a més, apareix un dímer més greu a l'extrem 3′, i apareix un dímer de 4 bases consecutives.Tot i que l'energia lliure no és alta, el dímer 3′ Chl pot afectar seriosament l'especificitat de l'amplificació i l'eficiència de l'amplificació.A més, cal comprovar si hi ha forquilles, heterodímers i desajustos.

Resultats de la detecció d'oligo7 Fig3
Detecció d'eficiència d'amplificació:
L'eficiència d'amplificació de la reacció de PCR afecta seriosament els resultats de la PCR.També en qRT-PCR, l'eficiència d'amplificació és especialment important per als resultats quantitatius.Eliminar altres substàncies, màquines i protocols del tampó de reacció.La qualitat dels primers també té una gran influència en l'eficiència d'amplificació de la qRT-PCR.Per garantir la precisió dels resultats, tant la quantificació de fluorescència relativa com la quantificació de fluorescència absoluta necessiten detectar l'eficiència d'amplificació dels primers.Es reconeix que l'eficiència efectiva d'amplificació qRT-PCR està entre el 85% i el 115%.Hi ha dos mètodes:
1. Mètode de corba estàndard:
a.Barrejar l'ADNc
b.Gradient de dilució
c.qPCR
d.Equació de regressió lineal per calcular l'eficiència d'amplificació
2. LinRegPCR
LinRegPCR és un programa per a l'anàlisi de dades de RT-PCR en temps real, també anomenades dades quantitatives de PCR (qPCR) basades en SYBR Green o química similar.El programa utilitza dades corregides no de referència, realitza una correcció de línia de base a cada mostra per separat, determina una finestra de linealitat i després utilitza l'anàlisi de regressió lineal per ajustar una línia recta a través del conjunt de dades de PCR.A partir del pendent d'aquesta línia es calcula l'eficiència de PCR de cada mostra individual.L'eficiència mitjana de la PCR per amplicó i el valor Ct per mostra s'utilitzen per calcular una concentració inicial per mostra, expressada en unitats de fluorescència arbitràries.Les dades d'entrada i sortida es fan mitjançant un full de càlcul Excel.Només mostra
cal barrejar, sense gradient
es requereixen passos:(Preneu Bole CFX96 com a exemple, no gaire màquina amb ABI clar)
experiment:és un experiment estàndard de qPCR.
Sortida de dades de qPCR:LinRegPCR pot reconèixer dues formes de fitxers de sortida: RDML o quantificació Resultat d'amplificació.De fet, és el valor de detecció en temps real del nombre de cicle i del senyal de fluorescència per part de la màquina, i l'amplificació s'obté mitjançant l'anàlisi del valor de canvi de fluorescència de l'eficiència del segment lineal.
Selecció de dades: En teoria, el valor RDML hauria de ser utilitzable.Es calcula que el problema del meu ordinador és que el programari no pot reconèixer RDML, de manera que tinc el valor de sortida d'Excel com a dades originals.Es recomana realitzar un cribratge aproximat de les dades primer, com ara la fallada d'afegir mostres, etc. Els punts es poden suprimir a les dades de sortida (per descomptat, no els podeu eliminar, LinRegPCR ignorarà aquests punts en la fase posterior)

Fig5 Exportació de dades de qPCR

Fig6 selecció de mostres candidates

Entrada de dades:Obriu resultats d'amplificació de qualificació.xls, → obriu LinRegPCR → fitxer → llegiu des de l'excel → seleccioneu els paràmetres tal com es mostra a la figura 7 → D'acord → feu clic a determinar les línies de base

Fig 7 passos d'entrada de dades linRegPCR

Resultat:Si no hi ha repetició, no cal agrupar.Si hi ha repetició, l'agrupació es pot editar a l'agrupació de mostres i s'introdueix el nom del gen a l'identificador i, a continuació, s'agruparà automàticament el mateix gen.Finalment, feu clic al fitxer, exporteu Excel i visualitzeu els resultats.Es mostrarà l'eficiència d'amplificació i els resultats R2 de cada pou.En segon lloc, si es divideix en grups, es mostrarà l'eficiència d'amplificació mitjana corregida.Assegureu-vos que l'eficiència d'amplificació de cada cebador estigui entre el 85% i el 115%.Si és massa gran o massa petit, vol dir que l'eficiència d'amplificació de l'encebador és deficient.

Fig 8 Resultat i sortida de dades

Procés experimental:
Requisits de qualitat de l'ARN:
Puresa:1.72.0 indica que hi pot haver isotiocianat residual.L'àcid nucleic net A260/A230 hauria d'estar al voltant de 2. Si hi ha una forta absorció a 230 nm, indica que hi ha compostos orgànics com els ions fenat.A més, es pot detectar mitjançant electroforesi en gel d'agarosa a l'1,5%.Assenyala el marcador, perquè el ssRNA no té desnaturalització i el logaritme del pes molecular no té una relació lineal i el pes molecular no es pot expressar correctament.Concentració: teòricamentnomenys de 100 ng/ul, si la concentració és massa baixa, la puresa generalment és baixa i no alta

Fig9 Gel d'ARN

A més, si la mostra és preciosa i la concentració d'ARN és alta, es recomana fer una alícuota després de l'extracció i diluir l'ARN fins a una concentració final de 100-300 ng/ul per a la transcripció inversa.Enel procés de transcripció inversa, quan es transcriu l'ARNm, s'utilitzen cebadors oligo (dt) que es poden unir específicament a cues de poliA per a la transcripció inversa, mentre que lncRNA i circRNA utilitzen cebadors hexàmers aleatoris (Random 6 mer) per a la transcripció inversa de l'ARN total.Moltes empreses han llançat ara kits de cua especials.Per al mètode de bucle de tija, el mètode de cua és més convenient, d'alt rendiment i estalvi de reactius, però l'efecte de distingir miRNAs de la mateixa família no hauria de ser tan bo com el mètode de bucle de tija.Cada kit de transcripció inversa té requisits per a la concentració d'encebadors específics de gens (bucles de tija).La referència interna utilitzada per a miRNA és U6.En el procés d'inversió del bucle de tija, s'hauria d'invertir un tub d'U6 per separat i s'han d'afegir directament els imprimadors frontal i posterior d'U6.Tant circRNA com lncRNA poden utilitzar HKG com a referència interna.Endetecció d'ADNc,
si no hi ha cap problema amb l'ARN, l'ADNc també hauria d'estar bé.Tanmateix, si es persegueix la perfecció de l'experiment, el millor és utilitzar un gen de referència intern (Reference gen, RG) que pugui distingir l'ADNg dels cds.En general, RG és un gen de neteja., HKG) tal com es mostra a la figura 10;En aquell moment, estava fent proteïnes d'emmagatzematge de soja i utilitzava actina7 que contenia introns com a referència interna.La mida del fragment amplificat d'aquest cebador a l'ADNg era de 452 pb, i si s'utilitzava l'ADNc com a plantilla, era de 142 pb.Aleshores, els resultats de la prova van trobar que una part de l'ADNc estava realment contaminada per l'ADNg, i també va demostrar que no hi havia cap problema amb el resultat de la transcripció inversa i que es podia utilitzar com a plantilla per a la PCR.És inútil fer l'electroforesi en gel d'agarosa directament amb ADNc, i és una banda difusa, que no és convincent.

Figura 10 Detecció d'ADNc

La determinació de les condicions de qPCREn general, no hi ha cap problema segons el protocol del kit, principalment en el pas de valor tm.Si alguns imprimadors no estan ben dissenyats durant el disseny de l'imprimació, donant lloc a una gran diferència entre el valor tm i els 60 °C teòrics, es recomana que l'ADNc després de barrejar les mostres, executeu una PCR de gradient amb imprimadors i intenteu evitar establir la temperatura sense bandes com a valor TM.

Anàlisi de dades

El mètode de processament quantitatiu de PCR de fluorescència relativa convencional és bàsicament segons 2-ΔΔCT.Plantilla de tractament de dades.

Productes relacionats:

PCR en temps real fàcil^TM –Taqman

PCR en temps real fàcil^TM -SYBR VERD I

RT Easy I (Premescla mestra per a la síntesi d'ADNc de la primera cadena)

RT Easy II (Premescla mestra per a la síntesi d'ADNc de la primera cadena per a qPCR)