La PCR en temps real, també coneguda com a PCR quantitativa o qPCR, és un mètode per al seguiment i anàlisi en temps real dels productes d'amplificació de PCR.
Com que la PCR quantitativa té els avantatges d'un funcionament senzill, ràpid i còmode, alta sensibilitat, bona repetibilitat i baixa taxa de contaminació, s'utilitza àmpliament en proves mèdiques, avaluació de l'eficàcia de fàrmacs, investigació d'expressió gènica, investigació transgènica, detecció de gens, detecció de patògens, detecció d'animals i plantes., proves d'aliments i altres camps.
Per tant, tant si us dediqueu a la investigació bàsica en ciències de la vida, com a empleats d'empreses farmacèutiques, ramaderes, empreses alimentàries o fins i tot empleats d'oficines d'inspecció d'entrada i sortida i quarantena, departaments de vigilància ambiental, hospitals i altres unitats, estaràs més o menys exposat a O necessites conèixer els coneixements sobre el domini de la PCR quantitativa.

Principi de PCR en temps real

La PCR en temps real és un mètode en què s'afegeixen substàncies fluorescents al sistema de reacció de PCR i la intensitat del senyal de fluorescència en el procés de reacció de PCR es controla en temps real mitjançant un instrument quantitatiu de PCR i, finalment, s'analitzen i processen les dades experimentals.

【Corba d'amplificació】és la corba que descriu el procés dinàmic de la PCR.La corba d'amplificació de la PCR no és en realitat una corba exponencial estàndard, sinó una corba sigmoide.

[Corba d'amplificació de la fase de plataforma]Amb l'augment del nombre de cicles de PCR, la inactivació de l'ADN polimerasa, l'esgotament de dNTPs i cebadors i la inhibició de la reacció de síntesi pel pirofosfat del subproducte de la reacció, etc., la PCR no sempre s'expandeix de manera exponencial., i finalment entrarà en un altiplà.

[Regió de creixement exponencial de la corba d'amplificació]Tot i que la fase d'altiplà varia molt, en una determinada regió de la regió de creixement exponencial de la corba d'amplificació, la repetibilitat és molt bona, la qual cosa és molt important per a l'anàlisi quantitativa de la PCR.

[Valor llindar i valor Ct]Establem el valor límit de detecció de fluorescència a la posició adequada a l'àrea de creixement exponencial de la corba d'amplificació, és a dir, el valor llindar (Threshold).La intersecció del valor llindar i la corba d'amplificació és el valor Ct, és a dir, el valor Ct fa referència al nombre de cicles (cicle llindar) quan s'arriba al valor llindar.

El gràfic següent mostra clarament la relació entre la línia de llindar i la corba d'amplificació, el llindar i el valor Ct.

【Com quantificar?】

La teoria matemàtica ha demostrat que el valor Ct té una relació lineal inversa amb el logaritme del nombre de plantilles inicials.Real Time PCR monitoritza els productes d'amplificació de PCR en temps real i els quantifica durant la fase d'amplificació exponencial.

Per a cada cicle de PCR, l'ADN va augmentar exponencialment 2 vegades i aviat va arribar a un altiplà.

Suposant que la quantitat d'ADN inicial és A₀ , després de n cicles, la quantitat teòrica de producte d'ADN es pot expressar com:

A _n =A ₀ ×2ⁿ

Aleshores, com més és la quantitat inicial d'ADN A 0, més aviat la quantitat del producte amplificat assoleix el valor de detecció An , i el nombre de cicles en arribar a An és el valor Ct.És a dir, com més gran sigui la quantitat inicial d'ADN A 0, més aviat serà el pic de la corba d'amplificació i, en conseqüència, el nombre de cicles requerits n és menor.

Realitzem una dilució en gradient de l'estàndard de concentració coneguda i l'utilitzem com a plantilla per a la PCR en temps real, i s'obtindran una sèrie de corbes d'amplificació a intervals iguals en l'ordre de la quantitat d'ADN inicial de més a menys.Segons la relació lineal entre el valor Ct i el logaritme del nombre de plantilles inicials, aEs pot crear [corba estàndard].

Substituint el valor Ct de la mostra amb concentració desconeguda a la corba estàndard, es pot obtenir la quantitat inicial de plantilla de la mostra amb concentració desconeguda, que és el principi quantitatiu de la PCR en temps real.

Mètode de detecció de PCR en temps real

La PCR en temps real detecta els productes d'amplificació de la PCR detectant la intensitat de fluorescència en el sistema de reacció.

Principi del mètode d'incrustació de colorants fluorescents】

Colorants fluorescents, com ara TB Green ® , poden unir-se de manera inespecífica a l'ADN de doble cadena en sistemes de PCR i fluoresceixen en unir-se.

La intensitat de fluorescència en el sistema de reacció va augmentar exponencialment amb l'augment dels cicles de PCR.En detectar la intensitat de fluorescència, la quantitat d'amplificació d'ADN en el sistema de reacció es pot controlar en temps real i, a continuació, es pot estimar inversament la quantitat de plantilla inicial a la mostra.

【Principi del mètode de la sonda fluorescent】

sonda fluorescentés una seqüència d'àcids nucleics amb un grup fluorescent a l'extrem 5′ i un grup d'extinció a l'extrem 3′, que es pot unir específicament a la plantilla.Quan la sonda està intacta, la fluorescència emesa pel fluoròfor és extingida pel grup d'extinció i no pot fluorescència.Quan la sonda es descomposa, la substància fluorescent es dissociarà i emetrà fluorescència.

S'afegeix una sonda fluorescent a la solució de reacció de PCR.Durant el procés de recuit, la sonda fluorescent s'uneix a la posició específica de la plantilla.Durant el procés d'extensió, l'activitat exonucleasa 5'→3' de l'enzim PCR pot descompondre la sonda fluorescent hibridada amb la plantilla, i la substància fluorescent es dissocia per emetre fluorescència.En detectar la intensitat de fluorescència de la sonda al sistema de reacció, es pot aconseguir el propòsit de controlar la quantitat d'amplificació del producte de PCR.

【Selecció del mètode de detecció de fluorescència】

Si s'utilitza per distingir seqüències amb alta homologia i realitzar una detecció de PCR múltiple com l'anàlisi de tipatge SNP, el mètode de la sonda fluorescent és insubstituïble.
Per a altres experiments de PCR en temps real, es pot utilitzar un mètode de quimera fluorescent senzill, fàcil i de baix cost.

sondesForta especificitat, capaç de múltiples PCR

Mancança

Requisits d'especificitat elevats per a l'amplificació;

no es pot realitzar la PCR múltiplex Necessitat de dissenyar sondes específiques, cost elevat;

de vegades el disseny de la sonda és difícil

Productes relacionats: