Consells per millorar la recuperació de la cola

1. Augmentar la càrrega de la mostra durant l'electroforesi.

2. Utilitzeu tampó d'electroforesi acabat de preparar.

3. Quan talleu cola, intenteu tallar només la cola amb tires per reduir el volum de tall de cola: no necessiteu cola amb pocs fragments de propòsit, en cas contrari afectarà la taxa de recuperació.

4. Després de fondre dues o més peces de cola, utilitzeu un tub per gran que sigui el volum i transferiu-lo a la mateixa columna.

5. La solució afegida al sol pot ser una mica més, la qual cosa és més favorable a la unió de l'ADN a la membrana, però generalment no supera els 750 ul.

6. La clau per a la recuperació del gel és unir l'ADN a la columna mitjançant la concentració de sal, l'acidesa (càrrega) i la hidrofobicitat de la solució de la columna.Per tant, si el pH del tampó d'electroforesi és massa alt, es poden afegir 10 ul (pH 5,0, 3mol/L NaAC) al sol;Per tal d'interceptar millor les molècules d'ADN a la membrana, es pot afegir un 30% d'isopropanol per escalfar el líquid després de dissoldre la cola.

7. Abans d'afegir l'eluent, deixar la columna a temperatura ambient durant uns minuts (uns 10 minuts) per evaporar completament l'etanol.

8. Finalment, afegiu menys eluent per minimitzar el volum de recuperació.Generalment, s'utilitzen 30-50 μl d'eluent per a l'elució (no massa poc, en cas contrari no podrà mullar la membrana, cosa que no és favorable a l'elució);les gotes d'elució es troben al centre de la membrana, per eluir completament l'ADN lligat a la membrana.

9. Després d'afegir l'eluent, es pot eluir en un bany maria de 55 graus durant 5 minuts o col·locar-lo en un bany maria de 50 graus durant més de 10 minuts, o segellar amb un parafilm a 4 graus durant la nit, i després centrifugar per recuperar-lo l'endemà, l'efecte és bo.

10.Afegiu l'eluat centrifugat de nou a la columna d'adsorció i centrifugueu de nou.

Mètodes i procediments detallats per a la recuperació de productes de PCR

1. Reciclatge de cautxú ordinari

Si voleu recuperar la cola, el millor és utilitzar un kit, que és convenient i té una taxa de recuperació una mica més alta.Si realment necessiteu recuperar-lo manualment, podeu afegir 3 vegades el volum de TE després de tallar la cola.Després de fondre's en un bany maria, s'extreuen netament fenol, fenol/cloroform i es precipita etanol.Això és.

2. Recuperació d'ADN a partir de gels de baix punt de fusió

Purificació de fragments d'ADN Afegiu TE (10 mmol/l Tris-HCl pH 8,0, 0,1 mmol/l EDTA) igual al volum del gel i poseu-lo en un bany maria a 65 °C durant 5 minuts per dissoldre completament el gel.

Després de portar-lo a temperatura ambient, es va afegir una quantitat igual de fenol (saturat amb TE, TE es va segellar a la capa superior i es va eliminar la capa inferior de fenol) i la barreja es va barrejar suaument (no cal barrejar) i es va centrifugar a 12.000 rpm durant 3 minuts.Repetiu 1-2 vegades.

Agafeu el sobrenedant, afegiu 0,1 volum d'acetat de sodi 3mol/L (pH 5,2) i 2,5 vegades el volum d'etanol absolut per dur a terme la precipitació d'etanol.Dissoldre l'ADN purificat amb una quantitat adequada de TE, mesurar-ne el contingut i preparar-lo per al seu ús (es pot utilitzar per a l'anàlisi de l'estructura del gen objectiu, la preparació de la sonda, etc.).

3. Recuperació de PCR amb bona especificitat d'amplificació

Si l'especificitat de l'amplificació per PCR és bona, és només una simple purificació i recuperació del producte de PCR.Podeu afegir 50 ug/ml de proteinasa K al producte de PCR, 37 graus durant 1 h, extreure una vegada amb fenol/cloroform, extreure una vegada amb cloroform i afegir 0,1 volum del sobrenedant.L'acetat de sodi es va recuperar per precipitació amb 2,5 volums d'etanol absolut.

Productes relacionats:

https://www.foreivd.com/pcr-purification-kit-2-product/

https://www.foreivd.com/blood-superdirecttm-pcr-kit-edta-product/