Fa poc he descobert una cosa sorprenent!Molts professionals de l'experimentació avançada al seu voltant ni tan sols coneixen alguns punts de coneixement experimental molt bàsic.

Per exemple, pots respondre les preguntes següents?

Hi ha alguna diferència entre OD260 i A260?Què vol dir cadascun?
OD és l'abreviatura de densitat òptica (densitat òptica), A és l'abreviatura d'absorbància (absorbància), els dos conceptes són en realitat els mateixos, "densitat òptica" és "absorbància", però "densitat òptica" està en línia amb la majoria dels estàndards nacionals i està més estandarditzat.

Normalment mesurem el valor OD a 260 nm per calcular la concentració d'àcid nucleic, doncs, què representa 1OD?
L'àcid nucleic té un pic d'absorció màxim a una longitud d'ona de 260 nm, que conté ADN i ARN, així com fragments d'àcid nucleic fragmentats (aquest és el punt clau).
El valor OD mesurat a una longitud d'ona de 260 nm es va registrar com a OD260.Si la mostra és pura, el valor OD260 pot calcular la concentració de la mostra d'àcid nucleic.
1 OD260=50 μg/ml dsDNA (ADN de doble cadena)
=37 μg/ml ssDNA (ADN monocatenari)
=40 μg/ml d'ARN
= 30 μg/ml dNTPs (oligonucleòtids)
Hi ha alguna connexió i diferència entre RT-PCR, Realtime-PCR i QPCR?
RT-PCR és l'abreviatura de PCR de transcripció inversa
Real Time PCR=qPCR, abreviatura de Quantitative Real Time PCR
Tot i que la PCR en temps real (PCR quantitativa fluorescent en temps real) i la PCR de transcripció inversa (PCR de transcripció inversa) semblen abreujar-se com a RT-PCR.Però la convenció internacional és: RT-PCR es refereix específicament a la PCR de transcripció inversa.

Quins són els nt, pb i kb que s'utilitzen habitualment per descriure la longitud de l'ADN/ARN en biologia?
nt = nucleòtid
bp = parell de bases parell de bases
kb = quilobase

Per descomptat, diríeu que a molta gent no els importen aquests petits detalls!Tothom ho fa, i ningú et preguntarà què és.Saps que això és innecessari, oi?

No, no, no, és molt necessari saber-ho!per què?
Perquè vols publicar un article!Germà!Tant si tens com a objectiu graduar-te o perseguir èxits de recerca científica, has de confiar en els articles per parlar!

L'extracció d'àcids nucleics hauria de ser l'experiment més senzill i bàsic.La qualitat de l'extracció d'àcids nucleics determina directament els resultats dels experiments posteriors.

Encara que ho he dit moltes vegades, encara hi ha molts amics que no els importa.Aquesta vegada he decidit sortir de l'article!

Informació mínima per a la publicació d'experiments quantitatius de PCR en temps real, denominats MIQE, és un conjunt de directrius d'experiments quantitatius de fluorescència llançats internacionalment, que proposa estàndards mínims per a la informació experimental necessària per avaluar experiments quantitatius de PCR amb fluorescència i publicar articles.Mitjançant les condicions experimentals i els mètodes d'anàlisi proporcionats per l'experimentador, els revisors poden avaluar millor la validesa de l'esquema experimental de l'investigador.

Es pot observar que en l'apartat d'extracció d'àcids nucleics s'han proposat els següents elements de detecció:

"E" indica la informació que s'ha de proporcionar i "D" indica la informació que s'ha de proporcionar si cal.

La forma és molt complicada, de fet, vull dir que tothom ha de començar

puresa (D), rendiment (D), integritat (E) i consistència (E) per avaluar els àcids nucleics en aquests quatre aspectes.

Segons els hàbits experimentals, primer parlem dels mètodes d'avaluació de la puresa i la concentració.

La mesura de DO és el mètode de detecció preferit i més fàcil per als experimentadors.Pel que fa al principi, no entraré en detalls aquí.Molts laboratoris utilitzen ara espectrofotòmetres ultramicro per analitzar directament quantitativament mostres d'àcid nucleic.Mentre es mostra el valor d'absorbància, el programa dóna directament el valor de concentració (àcid nucleic, proteïna i colorant fluorescent) i les proporcions relacionades.Pel que fa a l'anàlisi del valor OD, deseu aquesta imatge i us anirà bé.

Llista de solucions de valor OD universal

Tanmateix, hi ha algunes advertències que s'han de presentar per separat.

(Després de tot, sé que heu de ser vosaltres els que estalvieu i espereu fins que els necessiteu!)

Nota 1 Equip

El valor OD es veurà afectat per diferents equips.Mentre l'OD260 estigui dins d'un determinat rang, els valors de OD230 i OD280 són significatius.Per exemple, el rang d'absorbància de l'Eppendorf D30 comú a 260 nm és de 0 ~ 3A i el NanoDrop One de Thermo és a 260 nm.El rang d'absorbància de 0,5 ~ 62,5A.

Nota 2Reactiu de dilució

El valor de DO es pot veure afectat per la dilució de diferents reactius.Per exemple, la lectura OD260/280 d'ARN purificat en pH7,5 10 mM Trisel buffer està entre 1,9 i 2,1, mentre que ensolució aquosa neutrala proporció serà menor, potser només 1,8-2,0, però això no vol dir que la qualitat de l'ARN canviï Diferència.

Nota 3Substàncies residuals

L'existència de substàncies residuals afectarà la precisió de la mesura de la concentració d'àcids nucleics, per la qual cosa cal evitar al màxim els residus de proteïnes, fenols, polisacàrids i polifenols a les mostres d'àcids nucleics.

Tanmateix, de fet, l'extracció amb reactius orgànics és un mètode antic.En els kits comercials, l'efecte d'extracció es pot aconseguir mitjançant una columna d'adsorció a base de sílice combinada amb la centrifugació, evitant reactius orgànics tòxics i nocius difícils d'eliminar, etc. El problema, com araEl kit d'extracció d'àcids nucleics de Foregene, no utilitza DNasa/RNasa i reactius orgànics tòxics durant tota l'operació, ràpid i segur, i laefecte ésbo(va dir accidentalment que era calb, però sé que vols saber-ho).

Exemple 1: rendiment i puresa de l'extracció d'ADN genòmic

El kit d'aïllament d'ADN del sòl Foregene (DE-05511) tracta mostres de sòl de diverses fonts, i la quantitat i la puresa de l'ADN genòmic obtingut es mostren a la taula següent:
Exemple 2: Rendiment i puresa de l'extracció d'ARN dels teixits

El kit d'aïllament d'ARN total animal (RE-03012) va processar diverses mostres de teixit, i la quantitat i la puresa d'ARN obtinguda es mostren a la taula següent (per al teixit del ratolí):
Tanmateix, no penseu que heu acabat amb el valor OD.Tens alguna cura dels punts clau que t'he dibuixat al davant?

Avís

També es calcularan les molècules d'àcid nucleic fragmentades en l'absorbància.Suposant que teniu residus d'ADN genòmic a l'ARN, el vostre valor OD semblarà molt alt, però no es pot determinar la concentració real d'ARN.Si el vostre ARN és No està clar si hi ha degradació, de manera que encara necessitem un mètode d'avaluació exhaustiu per donar un judici més precís, és a dir, l'avaluació de la integritat de l'àcid nucleic esmentada a MIQE.