1. Coneixements bàsics (si voleu veure la part experimental, transferiu directament a la segona part)
Com a reacció derivada de la PCR convencional, la PCR en temps real supervisa principalment el canvi de la quantitat de producte d'amplificació en cada cicle de la reacció d'amplificació de la PCR en temps real mitjançant el canvi del senyal de fluorescència i analitza quantitativament la plantilla inicial mitjançant la relació entre el valor ct i la corba estàndard.
Les dades específiques de RT-PCR sónlínia de base, llindar de fluorescènciaiValor Ct.
| línia de base: | El valor de fluorescència del cicle 3r-15 és la línia de base (línia de base), que és causada per l'error ocasional de la mesura. |
| Llindar (llindar): | Es refereix al límit de detecció de fluorescència establert en una posició adequada a la regió de creixement exponencial de la corba d'amplificació, generalment 10 vegades la desviació estàndard de la línia de base. |
| Valor CT: | És el nombre de cicles de PCR quan el valor de fluorescència de cada tub de reacció arriba al llindar. El valor Ct és inversament proporcional a la quantitat de plantilla inicial. |
Mètodes d'etiquetatge habituals per a RT-PCR:
| mètode | avantatge | mancança | àmbit d'aplicació |
| SYBR VerdⅠ | Àmplia aplicabilitat, sensible, barat i convenient | Els requisits d'imprimació són alts, propensos a bandes no específiques | És adequat per a l'anàlisi quantitativa de diversos gens diana, la investigació sobre l'expressió gènica i la investigació sobre animals i plantes recombinants transgènics. |
| TaqMan | Bona especificitat i alta repetibilitat | El preu és alt i només apte per a objectius específics. | Detecció de patògens, investigació de gens de resistència a fàrmacs, avaluació de l'eficàcia de fàrmacs, diagnòstic de malalties genètiques. |
| far molecular | Alta especificitat, fluorescència, fons baix | El preu és alt, només és adequat per a un propòsit específic, el disseny és difícil i el preu és alt. | Anàlisi de gens específics, anàlisi SNP |
2. Passos experimentals
2.1 Sobre l'agrupament experimental- hi ha d'haver múltiples pous al grup, i hi ha d'haver repeticions biològiques.
| ① | Control en blanc | S'utilitza per detectar l'estat de creixement cel·lular en experiments |
| ② | SiRNA de control negatiu (seqüència de siRNA no específica) | Demostrar l'especificitat de l'acció de l'ARNi.siRNA pot induir una resposta d'estrès inespecífica a una concentració de 200 nM. |
| ③ | Control de reactius de transfecció | Exclou la toxicitat del reactiu de transfecció a les cèl·lules o l'efecte sobre l'expressió del gen objectiu |
| ④ | siRNA contra el gen objectiu | Eliminar l'expressió del gen objectiu |
| ⑤ (opcional) | siRNA positiu | S'utilitza per resoldre problemes operatius i del sistema experimental |
| ⑥ (opcional) | siRNA de control fluorescent | L'eficiència de la transfecció cel·lular es pot observar amb un microscopi |
2.2 Principis del disseny d'imprimacions
| Mida del fragment amplificat | Preferiblement a 100-150 pb |
| Primer Longitud | 18-25 pb |
| Contingut GC | 30%-70%, preferiblement 45%-55% |
| Valor Tm | 58-60 ℃ |
| Seqüència | Eviteu T/C continu;A/G continu |
| 3 seqüència final | Eviteu rics en GC o rics en AT;la base terminal és preferentment G o C;el millor és evitar T |
| Complementarietat | Eviteu seqüències complementàries de més de 3 bases dins del cebador o entre dos cebadors |
| Especificitat | Utilitzeu la cerca d'explosió per confirmar l'especificitat del primer |
①SiRNA és específic de l'espècie i les seqüències de diferents espècies seran diferents.
②SiRNA s'envasa en pols liofilitzat, que es pot emmagatzemar de manera estable durant 2-4 setmanes a temperatura ambient.
2.3 Eines o reactius que cal preparar prèviament
| Primer (referència interna) | Incloent dos cap endavant i cap enrere |
| Primers (gen objectiu) | Incloent dos cap endavant i cap enrere |
| ARN Si objectiu (3 tires) | En general, l'empresa sintetitzarà 3 tires i després escollirà una de les tres mitjançant RT-PCR |
| Kit de transfecció | Lipo2000, etc. |
| Kit d'extracció ràpida d'ARN | Per a l'extracció d'ARN després de la transfecció |
| Kit de transcripció inversa ràpida | per a la síntesi d'ADNc |
| Kit d'amplificació per PCR | 2 × Super SYBR Green qPCR Master Mix |
2.4 Pel que fa a les qüestions que cal prestar atenció en els passos experimentals específics:
①procés de transfecció de siRNA
1. Per a la placa, podeu triar una placa de 24 pous, una placa de 12 pous o una placa de 6 pous (la concentració mitjana d'ARN proposada a cada pou d'una placa de 24 pous és d'uns 100-300 ng/uL) i la densitat de transfecció òptima de les cèl·lules és de fins a un 60% -80% més o menys.
2. Els passos de transfecció i els requisits específics s'ajusten estrictament a les instruccions.
3. Després de la transfecció, les mostres es poden recollir en 24-72 hores per a la detecció d'ARNm (RT-PCR) o la detecció de proteïnes en 48-96 hores (WB)
② Procés d'extracció d'ARN
1. Evitar la contaminació per enzims exògens.Inclou principalment l'ús de màscares i guants estrictament;utilitzant puntes de pipeta esterilitzades i tubs EP;l'aigua utilitzada en l'experiment ha de ser lliure de RNasa.
2. Es recomana fer-ho dues vegades com es suggereix al kit d'extracció ràpida, la qual cosa millorarà realment la puresa i el rendiment.
3. El líquid residual no ha de tocar la columna d'ARN.
③ Quantificació de l'ARN
Després d'extreure l'ARN, es pot quantificar directament amb Nanodrop i la lectura mínima pot ser tan baixa com 10 ng/ul.
④Procés de transcripció inversa
1. A causa de l'alta sensibilitat de la RT-qPCR, s'han de fer almenys 3 pous paral·lels per a cada mostra per evitar que el Ct posterior sigui massa diferent o que la SD sigui massa gran per a l'anàlisi estadística.
2. No congeleu i descongeleu la Master Mix repetidament.
3. Cada tub/forat s'ha de substituir per una nova punta!No utilitzeu contínuament la mateixa punta de pipeta per afegir mostres!
4. La pel·lícula fixada a la placa de 96 pous després d'afegir la mostra s'ha de suavitzar amb una placa.El millor és centrifugar abans de posar-lo a la màquina, de manera que el líquid de la paret del tub pugui fluir cap avall i eliminar les bombolles d'aire.
⑤Anàlisi de corbes comuns
| No hi ha període de creixement logarítmic | Possiblement alta concentració de plantilla |
| Sense valor CT | Passos incorrectes per detectar senyals fluorescents; degradació d'encebadors o sondes: la seva integritat es pot detectar mitjançant electroforesi PAGE; quantitat insuficient de plantilla; degradació de les plantilles: evitant la introducció d'impureses i la congelació i descongelació repetida en la preparació de mostres; |
| Ct>38 | Baixa eficiència d'amplificació;El producte de PCR és massa llarg;es degraden diversos components de la reacció |
| Corba d'amplificació lineal | Les sondes es poden degradar parcialment per cicles de congelació-descongelació repetits o per exposició prolongada a la llum |
| La diferència de forats duplicats és especialment gran | La solució de reacció no es fon completament o la solució de reacció no es barreja;el bany termal de l'instrument de PCR està contaminat per substàncies fluorescents |
2.5 Sobre l'anàlisi de dades
L'anàlisi de dades de qPCR es pot dividir en quantificació relativa i quantificació absoluta.Per exemple, les cèl·lules del grup de tractament en comparació amb les del grup de control,
Quantes vegades canvia l'ARNm del gen X, això és una quantificació relativa;en un nombre determinat de cèl·lules, l'ARNm del gen X
Quants exemplars hi ha, això és una quantificació absoluta.Normalment, el que més fem servir al laboratori és el mètode quantitatiu relatiu.Generalment,el mètode 2-ΔΔcts'utilitza més en experiments, de manera que aquí només s'introduirà aquest mètode amb detall.
Mètode 2-ΔΔct: El resultat obtingut és la diferència en l'expressió del gen objectiu en el grup experimental respecte al gen objectiu en el grup control.Es requereix que les eficiències d'amplificació tant del gen objectiu com del gen de referència intern siguin properes al 100% i la desviació relativa no hagi de superar el 5%.
El mètode de càlcul és el següent:
Δct grup de control = valor ct del gen objectiu al grup control - valor ct del gen de referència intern al grup control
Δct grup experimental = valor ct del gen objectiu al grup experimental – valor ct del gen de referència interna al grup experimental
ΔΔct=Δct grup experimental-Δct grup control
Finalment, calculeu el múltiple de la diferència en el nivell d'expressió:
Canvia el plec = 2-ΔΔct (corresponent a la funció Excel és POTÈNCIA)
Productes relacionats:
Hora de publicació: 20-maig-2023
