Ⅰ. Augmenta la sensibilitat del sistema de reacció:
1. Separeu l'ARN d'alta qualitat:
La síntesi d'ADNc reeixida prové d'ARN d'alta qualitat.L'ARN d'alta qualitat hauria de garantir almenys un total més llarg i no conté inhibidors que no continguin enzims de registre, com ara EDTA o SDS.La qualitat de l'ARN determina el valor màxim de la informació de la seqüència que podeu transcriure a l'ADNc.El mètode general de purificació d'ARN és un mètode escalonat per utilitzar isoocianat/acidofenol.Per evitar la contaminació de la RNasa, l'ARN separat d'una mostra rica en RNasa (com el pàncrees) requereix emmagatzematge de formaldehid per estalviar ARN d'alta qualitat, que ho és encara més per a l'emmagatzematge a llarg termini.L'ARN extret del fetge de rata es va degradar bàsicament després d'una setmana d'emmagatzematge a l'aigua, mentre que l'ARN extret de la melsa de rata es va mantenir estable després de tres anys d'emmagatzematge a l'aigua.A més, les transcripcions de més de 4 kb són més sensibles a la degradació de la RNasa de traça que les transcripcions petites.Per tal d'augmentar l'estabilitat de la mostra d'ARN d'emmagatzematge, l'ARN es pot dissoldre en una metamamina d'ions i s'emmagatzema a -70 °C.El tilid utilitzat per estalviar ARN no ha de contenir cap objecte divers que degradi l'ARN.L'ARN, que es deriva del pàncrees, es pot estalviar en metalmamina durant almenys un any.Quan estigueu preparat per utilitzar l'ARN, podeu utilitzar els mètodes següents per precipitar l'ARN: afegir NaCl a 0,2 m i 4 vegades el volum d'etanol, col·locar a temperatura ambient durant 3-5 minuts i 10.000 × g centrífug durant 5 minuts.
2. Utilitzeu la transcriptasa inversa sense activitat RNaseH (RNaseH-):
Els inhibidors de la RNasa s'afegeixen sovint a les reaccions de transcripció inversa per augmentar la durada i el rendiment de la síntesi d'ADNc.L'inhibidor de la RNasa s'afegeix a la primera reacció de síntesi en cadena en presència de tampons i agents reductors com el DTT perquè el procés de síntesi pre-cDNA desnaturalitza l'inhibidor, alliberant així RNases unides que degraden l'ARN.L'inhibidor de la proteïna RNasa només prevé la degradació de l'ARN per la RNasa A, B, C, i no impedeix les RNases a la pell, per la qual cosa s'ha de tenir cura de no introduir RNases dels dits malgrat l'ús d'aquests inhibidors.
La transcriptasa inversa catalitza la conversió de l'ARN en ADNc.Tant M-MLV com AMV tenen activitat RNasaH endògena a més de la seva pròpia activitat polimerasa.L'activitat de la RNasaH competeix amb l'activitat de la polimerasa per les cadenes heterozigotes formades entre plantilles d'ARN i cebadors d'ADN o cadenes d'extensió d'ADNc, i degrada ARN: cadenes d'ARN en complexos d'ADN.Les plantilles d'ARN degradades per l'activitat RNasaH ja no es poden utilitzar com a substrats efectius per a la síntesi d'ADNc, reduint el rendiment i la durada de la síntesi d'ADNc.Així, eliminar o reduir molt l'activitat RNasaH de la transcriptasa inversa seria de gran benefici.
La transcriptasa inversa SuperScriptⅡ, la transcriptasa inversa MMLV de la RNaseH- i la transcriptasa inversa thermoScript, l'AMV de la RNaseH- van produir més ADNc de longitud completa que MMLV i AMV.La sensibilitat de la RT-PCR es veu afectada per la quantitat d'ADNc sintetitzat.ThermoScript és molt més sensible que AMV.La mida dels productes RT-PCR està limitada per la capacitat de la transcriptasa inversa de sintetitzar ADNc, especialment quan es clonen Cdnas més grans.En comparació amb MMLV, SuperScripⅡ va augmentar significativament el rendiment dels productes llargs de RT-PCR.La transcriptasa inversa de RNaseH- també augmenta l'estabilitat tèrmica, de manera que la reacció es pot dur a terme a temperatures superiors al normal de 37-42 ℃.Sota les condicions de síntesi suggerides, es van utilitzar primers oligo (dT) i 10 μCi α-p dCTP.La producció total de la primera cadena es va calcular mitjançant el mètode de precipitació TCA.L'ADNc de longitud completa es va analitzar mitjançant l'eliminació de tires ordenades per mida i el recompte en un gel d'agarosa alcalina.
3. Augmenta la temperatura de conservació de la calor de la transcripció inversa:
Una temperatura de retenció més alta ajuda a obrir l'estructura secundària de l'ARN i augmentar el rendiment de la reacció.Per a la majoria de plantilles d'ARN, mantenir l'ARN i el cebador a 65 ° C sense tampó ni sal i després refredar-los ràpidament sobre gel elimina la majoria de les estructures secundàries i permet que els cebadors s'uneixin.Tanmateix, algunes plantilles encara tenen una estructura secundària, fins i tot després de la desnaturalització tèrmica.L'amplificació d'aquestes plantilles difícils es pot realitzar mitjançant la transcriptasa inversa ThermoScript i col·locant la reacció de la transcriptasa inversa a temperatures més altes per millorar l'amplificació.Les temperatures de retenció més altes també poden augmentar l'especificitat, especialment quan la síntesi d'ADNc es realitza mitjançant cebadors específics de gens (GSPS) (vegeu el capítol 3).Si utilitzeu GSP, assegureu-vos que el valor de Tm de l'imprimació sigui el mateix que la temperatura de retenció esperada.No utilitzeu oligo (dT) i imprimadors aleatoris per sobre de 60 ℃.Les imprimacions aleatòries s'han de mantenir a 25 ℃ durant 10 minuts abans d'augmentar a 60 ℃.A més d'utilitzar temperatures de transcripció inversa més altes, es pot millorar l'especificitat transferint directament la barreja d'ARN/imprimació de la temperatura de desnaturalització de 65 ℃ a la temperatura de retenció de la transcripció inversa i afegint una barreja de reacció 2x preescalfada (síntesi d'inici tèrmica d'ADNc).Aquest enfocament ajuda a prevenir l'aparellament de bases intermoleculars que es produeix a temperatures més baixes.L'ús d'un instrument de PCR simplifica els molts interruptors de temperatura necessaris per a la RT-PCR.
La Tth polimerasa estabilitzada per calor actua com a DNA polimerasa en presència de Mg2+ i ARN polimerasa en presència de Mn2+.Pot contenir la calor fins a 65 ℃.Tanmateix, la presència de Mn2+ durant la PCR redueix la fidelitat, cosa que fa que la polimerasa Tth sigui menys adequada per a l'amplificació d'alta precisió, com ara la clonació d'ADNc.A més, la Tth és menys eficient en la transcripció inversa, la qual cosa redueix la sensibilitat, i com que un únic enzim pot realitzar transcripció inversa i PCR, les reaccions de control sense transcripció inversa no es poden utilitzar per distingir els productes amplificats de l'ADNc dels d'ADN genòmic contaminat.
4. Additiu que promou la transcripció inversa:
L'addició d'additius, incloent glicerina i DMSO, a la primera reacció de síntesi en cadena pot reduir l'estabilitat de la doble cadena d'àcid nucleic i desenrotllar l'estructura secundària de l'ARN.Es pot afegir fins a un 20% de glicerina o un 10% de DMSO sense afectar l'activitat de SuperScriptⅡ o MMLV.L'AMV també pot tolerar fins a un 20% de glicerol sense reduir l'activitat.Per maximitzar la sensibilitat de la RT-PCR a la reacció de transcripció inversa SuperScriptⅡ, es pot afegir un 10% de glicerol i aïllar-se a 45 ℃.Si s'afegeix 1/10 del producte de la reacció de retrotranscripció a la PCR, la concentració de glicerol en la reacció d'amplificació és del 0,4%, que no és suficient per inhibir la PCR.
5. Processament de RNaseH:
La sensibilitat es pot millorar tractant les reaccions de síntesi d'ADNc amb RNasaH abans de la PCR.Per a algunes plantilles, es creu que l'ARN de la reacció de síntesi d'ADNc impedeix la unió de productes amplificats, en aquest cas el tractament amb RNasaH pot augmentar la sensibilitat.En general, el tractament amb RNaseH es requereix per a l'amplificació d'una plantilla diana d'ADNc de longitud completa relativament llarga, com ara l'esquerosi tuberosaⅡ amb còpia baixa.Per a aquesta plantilla difícil, RNaseH va millorar el senyal generat per l'ADNc sintetitzat per SuperScriptⅡ o AMV.Per a la majoria de reaccions RT-PCR, el tractament amb RNaseH és opcional perquè el pas de desnaturalització de la PCR aïllada a 95 ℃ normalment hidrolitza l'ARN del complex ARN: ADN.
6. Mètodes millorats per detectar petites quantitats d'ARN:
La RT-PCR és especialment difícil quan només hi ha petites quantitats d'ARN disponibles.L'addició de glucogen com a portador durant la separació de l'ARN ajuda a augmentar el rendiment de mostres petites.Es pot afegir un glicogen lliure de RNasa al mateix temps que Trizol.El glicogen és soluble en aigua i pot romandre en fase aquosa amb ARN per ajudar a la precipitació posterior.La concentració recomanada de glicogen lliure de RNasa és de 250 μg/ml per a mostres de menys de 50 mg de teixit o 106 cèl·lules cultivades.
L'addició de BSA acetilat a les reaccions de transcripció inversa mitjançant SuperScriptⅡ pot augmentar la sensibilitat, i per a petites quantitats d'ARN, reduir la quantitat de SuperScriptⅡ i afegir 40 unitats d'inhibidor de nucleasa RnaseOut pot millorar el nivell de detecció.Si s'utilitza glucogen en la separació d'ARN, encara es recomana l'addició d'inhibidors de BSA o RNasa per revertir les reaccions de transcripció mitjançant SuperScriptⅡ.
Ⅱ. Augmentar l'especificitat de la RT-PCR
1. Síntesi de cNDA:
Es poden utilitzar tres mètodes diferents per iniciar la síntesi d'ADNc de la primera cadena i l'especificitat relativa de cada mètode afecta la quantitat i el tipus d'ADNc sintetitzat.
El mètode d'imprimació aleatòria és el menys específic dels tres mètodes.Els cebadors es recopilen en diversos llocs al llarg de la transcripció per produir un ADNc curt i de longitud parcial.Aquest mètode s'utilitza sovint per obtenir seqüències terminals 5′ i ADNc a partir de plantilles d'ARN amb regions estructurals secundàries o amb llocs de terminació que la transcriptasa inversa no es pot replicar.Per obtenir l'ADNc més llarg, s'ha de determinar empíricament la proporció d'encebadors i ARN de cada mostra d'ARN.La concentració inicial de cebadors aleatoris oscil·la entre 50 i 250 ng per sistema de reacció de 20 μl.Com que l'ADNc sintetitzat a partir de l'ARN total mitjançant cebadors aleatoris és principalment ARN ribosòmic, generalment es selecciona poli(A) + ARN com a plantilla.
La iniciació d'oligo(dT) és més específica que els cebadors aleatoris.S'hibrida amb la cua poli(A) que es troba a l'extrem 3' de l'ARNm a la majoria de cèl·lules eucariotes.Com que el poli (A) + ARN és aproximadament de l'1% al 2% de l'ARN total, la quantitat i complexitat de l'ADNc és molt menor que si s'utilitzessin cebadors aleatoris.A causa de la seva alta especificitat, l'oligo(dT) generalment no requereix optimització per a la relació d'ARN a cebador i la selecció de poli(A)+.Es recomana utilitzar 0,5 μg d'oligo (dT) per sistema de reacció de 20 μl.oligo (dT) 12-18 és adequat per a la majoria de RT-PCR.El sistema ThermoScript RT-PCR proporciona oligo(dT)20 a causa de la seva bona estabilitat tèrmica i és adequat per a temperatures de manteniment més altes.
Els primers específics de gens (GSP) són els millors primers específics per al pas de transcripció inversa.El GSP és un oligonucleòsid antisentit que es pot hibridar específicament amb seqüències de destinació d'ARN, en lloc de recucer tots els Rnas com cebadors aleatoris o oligo(dT).Les regles utilitzades per dissenyar cebadors de PCR també s'apliquen al disseny de la reacció de transcripció inversa GSP.El GSP pot ser la mateixa seqüència que el cebador d'amplificació recuit al final de l'ARNm3', o el GSP es pot dissenyar per ser recuit aigües avall amb el cebador d'amplificació inversa.Per a alguns objectes amplificats, és necessari dissenyar més d'un cebador antisentit per a una RT-PCR exitosa perquè l'estructura secundària de l'ARN objectiu pot evitar que l'imprimació s'uneixi.Es recomana utilitzar 1 pmol GSP antisentit en el primer sistema de reacció de síntesi en cadena de 20 μl.
2. Augmenta la temperatura de conservació de la calor de la transcripció inversa:
Per tal d'aprofitar al màxim l'especificitat GSP, s'ha d'utilitzar la transcriptasa inversa amb alta estabilitat tèrmica.La transcriptasa inversa estable a la calor es pot aïllar a temperatures més altes per augmentar el rigor de la reacció.Per exemple, si un GSP es recuita a 55 °C, aleshores l'especificitat de GSP no s'utilitza completament si la transcripció inversa es realitza a 37 °C amb baix rigor mitjançant AMV o M-MLV.Tanmateix, SuperScripⅡ i ThermoScript poden reaccionar a 50 ℃ o més, la qual cosa elimina els productes inespecífics produïts a temperatures més baixes.Per obtenir la màxima especificitat, la barreja d'ARN/imprimació es pot transferir directament des de la temperatura de desnaturalització de 65 ℃ a la temperatura de retenció de la transcripció inversa amb l'addició d'una barreja de reacció preescalfada 2 x (inici tèrmic de la síntesi d'ADNc).Això ajuda a prevenir l'aparellament de bases entre molècules a baixes temperatures.L'ús d'un instrument de PCR simplifica les moltes transicions de temperatura necessàries per a la RT-PCR.
3. Reduir la contaminació de l'ADN genòmic:
Una dificultat potencial amb la RT-PCR és que l'ARN contamina l'ADN genòmic.L'ús de millors mètodes de separació d'ARN, com ara el reactiu Trizol, redueix la contaminació de l'ADN genòmic en les preparacions d'ARN.Per evitar productes produïts a partir d'ADN genòmic, l'ARN es pot tractar amb ADNⅠ de grau d'amplificació per eliminar l'ADN contaminat abans de la transcripció inversa.Les mostres es van mantenir a 65 ℃ en EDTA 2,0 mM durant 10 minuts per acabar la digestió de la DNasaⅠ.L'EDTA quela els ions de magnesi per evitar la hidròlisi de l'ARN depenent dels ions magnesi que es produeix a altes temperatures.
Per tal de separar l'ADNc amplificat del producte d'amplificació de l'ADN del genoma, es poden dissenyar cebadors que s'apropin per separat amb l'exó separat.Els productes de PCR derivats de l'ADNc seran més curts que els derivats de l'ADN genòmic contaminat.També es realitza un experiment controlat sense transcripció inversa a cada plantilla d'ARN per determinar si un fragment determinat és d'ADN genòmic o ADNc.Els productes de PCR obtinguts en absència de transcripció inversa es deriven del genoma.
Producte relacionat
-El kit d'un sol pas permet realitzar la transcripció inversa i la PCR en el mateix tub.Només cal afegir ARN plantilla, cebadors de PCR específics i ddH lliure de RNasa2O.
-L'anàlisi quantitativa en temps real de l'ARN es pot dur a terme de manera ràpida i precisa.
-El kit utilitza un reactiu de transcripció inversa Foregene únic i Foregene HotStar Taq DNA Polymerase combinat amb un sistema de reacció únic per millorar eficaçment l'eficiència d'amplificació i l'especificitat de la reacció.
-El sistema de reacció optimitzat fa que la reacció tingui una sensibilitat de detecció més alta, una estabilitat tèrmica més forta i una millor tolerància.
-Capacitat eficient per eliminar gDNA, que pot eliminar gDNA de la plantilla en 2 minuts.
-Sistema de transcripció inversa eficaç, només triguen 15 minuts a completar la síntesi de la primera cadena d'ADNc.
-Plantilles complexes: les plantilles amb un alt contingut de GC i una estructura secundària complexa també es poden revertir amb alta eficiència.
-Sistema de transcripció inversa d'alta sensibilitat, les plantilles de nivell pg també poden obtenir ADNc d'alta qualitat.
-El sistema de transcripció inversa té una alta estabilitat tèrmica, la temperatura de reacció òptima és de 42 ℃ i encara té un bon rendiment de transcripció inversa a 50 ℃.
Hora de publicació: Mar-07-2023
