一、Augmentar la sensibilitat del sistema de reacció:

1. Aïllar ARN d'alta qualitat:

La síntesi d'ADNc reeixida prové d'ARN d'alta qualitat.L'ARN d'alta qualitat ha de ser almenys de longitud completa i lliure d'inhibidors de la transcriptasa inversa com l'EDTA o SDS.La qualitat de l'ARN determina la quantitat màxima d'informació de la seqüència que podeu transcriure a l'ADNc.Un mètode comú de purificació d'ARN és un mètode d'un sol pas que utilitza isotiocianat de guanidina/fenol àcid.Per evitar la contaminació per petites quantitats d'RNasa, l'ARN aïllat de mostres riques en RNasa (com el pàncrees) s'ha d'emmagatzemar en formaldehid per preservar l'ARN d'alta qualitat, especialment per a l'emmagatzematge a llarg termini.L'ARN extret del fetge de rata es va degradar bàsicament després d'haver estat emmagatzemat a l'aigua durant una setmana, mentre que l'ARN extret de la melsa de rata es va mantenir estable després de ser emmagatzemat a l'aigua durant 3 anys.A més, les transcripcions de més de 4 kb són més sensibles a la degradació per traces de RNases que les transcripcions petites.Per augmentar l'estabilitat de les mostres d'ARN emmagatzemades, l'ARN es pot dissoldre en formamida desionitzada i emmagatzemar-se a -70 °C.La formamida que s'utilitza per preservar l'ARN ha d'estar lliure de residus que degraden l'ARN.L'ARN del pàncrees es pot conservar en formamida durant almenys un any.Quan us prepareu per utilitzar l'ARN, podeu utilitzar el següent mètode per precipitar l'ARN: afegiu NaCl a 0,2 M i 4 vegades el volum d'etanol, poseu-lo a temperatura ambient durant 3-5 minuts i centrifugueu a 10.000 × g durant 5 minuts.

2. Utilitzeu la transcriptasa inversa RNaseH-inactiva (RNaseH-):

Els inhibidors de la RNasa s'afegeixen sovint a les reaccions de transcripció inversa per augmentar la durada i el rendiment de la síntesi d'ADNc.Els inhibidors de la RNasa s'han d'afegir durant la reacció de síntesi de la primera cadena en presència d'un tampó i un agent reductor (com el DTT), perquè el procés previ a la síntesi d'ADNc desnaturalitza l'inhibidor, alliberant així la RNasa unida que pot degradar l'ARN.Els inhibidors de la proteïna RNasa només eviten la degradació de l'ARN per la RNasa A, B, C i no impedeixen la RNasa a la pell, així que aneu amb compte de no introduir RNasa dels dits malgrat l'ús d'aquests inhibidors.

La transcriptasa inversa catalitza la conversió d'ARN a ADNc.Tant M-MLV com AMV tenen activitat RNasaH endògena a més de la seva pròpia activitat polimerasa.L'activitat de la RNasaH i l'activitat de la polimerasa competeixen entre elles per la cadena híbrida formada entre la plantilla d'ARN i l'amortidor d'ADN o cadena d'extensió d'ADNc, i degraden la cadena d'ARN en el complex ARN:ADN.La plantilla d'ARN degradada per l'activitat RNasaH ja no pot servir com a substrat eficaç per a la síntesi d'ADNc, la qual cosa redueix el rendiment i la durada de la síntesi d'ADNc.Per tant, seria beneficiós eliminar o reduir en gran mesura l'activitat RNasaH de la transcriptasa inversa.。

La transcriptasa inversa SuperScript Ⅱ, la transcriptasa inversa RNaseH-MMLV i la transcriptasa inversa thermoScript, RNaseH-AMV, poden obtenir més quantitat i més ADNc de longitud completa que MMLV i AMV.La sensibilitat de la RT-PCR es veurà afectada per la quantitat de síntesi d'ADNc.ThermoScript és molt més sensible que AMV.La mida dels productes RT-PCR està limitada per la capacitat de la transcriptasa inversa de sintetitzar ADNc, especialment quan es clonen ADNc més grans.En comparació amb MMLV, SuperScripⅡ va augmentar significativament el rendiment dels productes llargs de RT-PCR.La transcriptasa inversa RNaseH també té una termoestabilitat augmentada, de manera que la reacció es pot realitzar a temperatures superiors a les normals de 37-42 °C.En les condicions de síntesi suggerides, utilitzeu oligo(dT) primer i 10 μCi de [α-P]dCTP.El rendiment total de la primera cadena es va calcular mitjançant el mètode de precipitació TCA.L'ADNc de longitud completa es va analitzar mitjançant bandes ordenades per mida extirpades i comptades amb un gel d'agarosa alcalina.

3. Augmenta la temperatura d'incubació per a la transcripció inversa:

Una temperatura d'incubació més alta ajuda a obrir l'estructura secundària de l'ARN, augmentant el rendiment de la reacció.Per a la majoria de plantilles d'ARN, incubar l'ARN i els cebadors a 65 ° C sense tampó ni sal, seguit d'un refredament ràpid sobre gel, eliminarà la majoria de les estructures secundàries i permetrà que els cebadors s'uneixin.Tanmateix, algunes plantilles encara tenen estructures secundàries, fins i tot després de la desnaturalització per calor.L'amplificació d'aquestes plantilles difícils es pot realitzar mitjançant la transcriptasa inversa ThermoScript i col·locant la reacció de transcripció inversa a una temperatura més alta per millorar l'amplificació.Les temperatures d'incubació més altes també poden augmentar l'especificitat, especialment quan s'utilitzen cebadors específics de gens (GSP) per a la síntesi d'ADNc (vegeu el capítol 3).Si utilitzeu GSP, assegureu-vos que la Tm dels primers sigui la mateixa que la temperatura d'incubació esperada.No utilitzeu oligo(dT) i imprimadors aleatoris per sobre de 60 °C.Els primers aleatoris requereixen incubació a 25 °C durant 10 minuts abans d'augmentar a 60 °C.A més d'utilitzar una temperatura de transcripció inversa més alta, també es pot millorar l'especificitat transferint directament la barreja d'ARN/primer de la temperatura de desnaturalització de 65 ° C a la temperatura d'incubació de transcripció inversa i afegint una barreja de reacció 2x preescalfada (síntesi d'inici en calent d'ADNc).Aquest enfocament ajuda a prevenir l'aparellament de bases intermoleculars que es produeix a temperatures més baixes.El canvi de temperatura múltiple necessari per a la RT-PCR es pot simplificar utilitzant un termociclador.

La Tth polimerasa termoestable actua com a DNA polimerasa en presència de Mg2+ i com a ARN polimerasa en presència de Mn2+.Es pot mantenir calent a una temperatura màxima de 65 °C.Tanmateix, la presència de Mn2 + durant la PCR redueix la fidelitat, cosa que fa que la polimerasa Tth sigui menys adequada per a l'amplificació d'alta precisió, com ara la clonació d'ADNc.A més, el Tth té una baixa eficiència de transcripció inversa, que redueix la sensibilitat i, com que la transcripció inversa i la PCR es poden realitzar amb un únic enzim, no es poden utilitzar reaccions de control sense transcripció inversa per comparar productes d'amplificació d'ADNc amb ADN genòmic contaminant.Els productes d'amplificació es van separar.

4. Additius que promouen la transcripció inversa:

S'afegeixen additius que inclouen glicerol i DMSO a la reacció de síntesi de la primera cadena, que pot reduir l'estabilitat de la doble cadena d'àcid nucleic i deslligar l'estructura secundària de l'ARN.Es pot afegir fins a un 20% de glicerol o un 10% de DMSO sense afectar l'activitat de SuperScript II o MMLV.L'AMV també pot tolerar fins a un 20% de glicerol sense pèrdua d'activitat.Per tal de maximitzar la sensibilitat de RT-PCR a la reacció de transcripció inversa SuperScriptⅡ, es pot afegir un 10% de glicerol i incubar-lo a 45 ° C.Si s'afegeix 1/10 del producte de la reacció de transcripció inversa a la PCR, la concentració de glicerol a la reacció d'amplificació és del 0,4%, cosa que no és suficient per inhibir la PCR.

5. Tractament RNaseH:

El tractament de les reaccions de síntesi d'ADNc amb RNasaH abans de la PCR pot augmentar la sensibilitat.Per a algunes plantilles, es creu que l'ARN en la reacció de síntesi d'ADNc impedeix la unió dels productes d'amplificació, en aquest cas el tractament amb RNasaH pot augmentar la sensibilitat.En general, el tractament amb RNaseH és necessari quan s'amplifiquen plantilles diana d'ADNc de longitud completa més llargues, com ara l'esquerosi tuberosa II de còpia baixa.Per a aquesta plantilla difícil, el tractament amb RNaseH va millorar el senyal produït per SuperScript II o l'ADNc sintetitzat per AMV.Per a la majoria de reaccions RT-PCR, el tractament amb RNasaH és opcional, perquè l'etapa de desnaturalització de la PCR a 95 °C generalment hidrolitza l'ARN del complex ARN:ADN.

6. Millora del mètode de detecció d'ARN petit:

La RT-PCR és especialment difícil quan només hi ha petites quantitats d'ARN disponibles.El glicogen afegit com a portador durant l'aïllament de l'ARN ajuda a augmentar el rendiment de mostres petites.Es pot afegir glicogen lliure de RNasa alhora que s'afegeix Trizol.El glicogen és soluble en aigua i es pot mantenir en fase aquosa amb ARN per ajudar a la precipitació posterior.Per a mostres de menys de 50 mg de teixit o 106 cèl·lules cultivades, la concentració recomanada de glicogen lliure de RNasa és de 250 μg/ml.

L'addició de BSA acetilada a la reacció de transcripció inversa mitjançant SuperScript II pot augmentar la sensibilitat i, per a petites quantitats d'ARN, reduir la quantitat de SuperScript II i afegir 40 unitats d'inhibidor de la nucleasa RNaseOut pot augmentar el nivell de detecció.Si s'utilitza glicogen en el procés d'aïllament de l'ARN, encara es recomana afegir un inhibidor de BSA o RNasa quan s'utilitza SuperScript II per a la reacció de transcripció inversa.

Augmenta l'especificitat de RT-PCR

1. Síntesi CND:

La síntesi d'ADNc de la primera cadena es pot iniciar mitjançant tres mètodes diferents, l'especificitat relativa dels quals afecta la quantitat i el tipus d'ADNc sintetitzat.

El mètode d'imprimació aleatòria va ser el menys específic dels tres mètodes.Els primers s'acumulen a diversos llocs al llarg de la transcripció, generant ADNc curts i de longitud parcial.Aquest mètode s'utilitza freqüentment per obtenir seqüències finals 5′ i per obtenir ADNc a partir de plantilles d'ARN amb regions d'estructura secundària o amb llocs de terminació que no es poden replicar per transcriptasa inversa.Per obtenir l'ADNc més llarg, s'ha de determinar empíricament la proporció d'encebadors i ARN de cada mostra d'ARN.La concentració inicial d'encebadors aleatoris va oscil·lar entre 50 i 250 ng per 20 μl de reacció.Com que l'ADNc sintetitzat a partir de l'ARN total mitjançant cebadors aleatoris és principalment ARN ribosòmic, generalment s'escull poli(A)+ARN com a plantilla.

Els cebadors oligo(dT) són més específics que els cebadors aleatoris.S'hibrida amb la cua poli(A) que es troba a l'extrem 3' de la majoria dels ARNm eucariotes.Com que l'ARN poli(A)+ és aproximadament entre l'1% i el 2% de l'ARN total, la quantitat i la complexitat de l'ADNc és molt menor que amb cebadors aleatoris.A causa de la seva alta especificitat, oligo(dT) generalment no requereix optimització de la proporció d'ARN a cebadors i selecció de poli(A)+.Es recomana utilitzar 0,5 μg d'oligo (dT) per sistema de reacció de 20 μl.oligo (dT) 12-18 és adequat per a la majoria de RT-PCR.El sistema ThermoScript RT-PCR ofereix oligo(dT)20 a causa de la seva millor estabilitat tèrmica per a temperatures d'incubació més altes.

Els cebadors específics de gens (GSP) són els primers més específics per al pas de transcripció inversa.El GSP és un oligonucleòtid antisentit que es pot hibridar específicament amb la seqüència diana d'ARN, a diferència dels cebadors aleatoris o l'oligo(dT), que s'apropen a tots els ARN.Les mateixes regles que s'utilitzen per dissenyar primers de PCR s'apliquen al disseny de GSP en reaccions de transcripció inversa.El GSP pot ser la mateixa seqüència que el cebador d'amplificació que s'acua a l'extrem més 3′ de l'ARNm, o el GSP es pot dissenyar per recuit aigües avall del cebador d'amplificació inversa.Per a alguns subjectes amplificats, s'ha de dissenyar més d'un cebador antisentit per a una RT-PCR amb èxit perquè l'estructura secundària de l'ARN objectiu pot impedir la unió del primer.Es recomana utilitzar 1 pmol de GSP antisentit en una reacció de síntesi de primera cadena de 20 μl.

2. Augmenta la temperatura d'incubació per a la transcripció inversa:

Per aprofitar al màxim l'avantatge de l'especificitat GSP, s'ha d'utilitzar una transcriptasa inversa amb una termoestabilitat més alta.Les transcriptases inverses termoestables es poden incubar a temperatures més altes per augmentar l'estricte de la reacció.Per exemple, si un GSP recuita a 55 °C, l'especificitat del GSP no s'utilitzarà completament si s'utilitza AMV o M-MLV per a la transcripció inversa a una baixa rigorositat de 37 °C.Tanmateix, SuperScript II i ThermoScript poden reaccionar a 50 °C o més, la qual cosa eliminarà els productes no específics generats a temperatures més baixes.Per obtenir la màxima especificitat, la barreja d'ARN/primer es pot transferir directament des de la temperatura de desnaturalització de 65 ° C a la temperatura d'incubació de transcripció inversa i afegir-la a una barreja de reacció 2 × preescalfada (inici en calent de síntesi d'ADNc).Això ajuda a prevenir l'aparellament de bases intermoleculars a baixes temperatures.Les múltiples transicions de temperatura necessàries per a la RT-PCR es poden simplificar utilitzant un termociclador.

3. Redueix la contaminació de l'ADN genòmic:

Una dificultat potencial que es troba amb la RT-PCR és la contaminació de l'ADN genòmic a l'ARN.L'ús d'un bon mètode d'aïllament d'ARN, com ara el reactiu Trizol, reduirà la quantitat d'ADN genòmic que contamina la preparació d'ARN.Per evitar productes derivats de l'ADN genòmic, l'ARN es pot tractar amb DNasa I de grau d'amplificació per eliminar l'ADN contaminant abans de la transcripció inversa.La digestió de la DNasa I es va acabar incubant les mostres en EDTA 2,0 mM durant 10 minuts a 65 °C.L'EDTA pot quelar els ions de magnesi, evitant la hidròlisi de l'ARN depenent dels ions de magnesi a altes temperatures.

Per tal de separar l'ADNc amplificat dels productes contaminants d'amplificació d'ADN genòmic, es poden dissenyar primers que cada recuit per separar els exons.Els productes de PCR derivats de l'ADNc seran més curts que els derivats de l'ADN genòmic contaminat.A més, es va realitzar un experiment de control sense transcripció inversa a cada plantilla d'ARN per determinar si un fragment determinat derivava d'ADN genòmic o ADNc.El producte de PCR obtingut sense transcripció inversa deriva del genoma.