Tothom parla del principi de l'experiment qRT-PCR, disseny d'imprimació, interpretació de resultats, etc., però crec que hauria de compartir amb vosaltres el funcionament experimental de qRT-PCR.És petit, però es tracta de resultats.

Abans de fer qRT-PCR, hem de tenir una comprensió clara del nostre propi ARN i els mètodes de funcionament.Al cap i a la fi, els nostres esforços estan dirigits a obtenir resultats, en lloc de simplement practicar.Per tant, abans de fer qRT-PCR, hem de determinar els problemes següents (alguns dels quals només són aplicables a SYBR).

1 Esteu segur que el vostre ARN no està degradat?

NanoDrop 2000 només pot detectar la concentració i la puresa de l'ARN, però no pot detectar la integritat de l'ARN.

El valor d'ARN (RNA Intesity Number) pot reflectir la integritat de l'ARN, que detecta el sistema Agilent 2100 Bioanalyzer.

Fig. Diagrama esquemàtic dels valors de RIN per a diferents mostres d'ARN (eucariotes)

Tanmateix, els laboratoris generalment no disposen del Bioanalyzer Agilent 2100.En aquest cas, podem detectar mitjançant gel de formaldehid, però el requisit de la quantitat total d'ARN és elevat, de manera que el mètode més ràpid és utilitzar l'electroforesi en gel normal.Es requereix que estigui en un entorn lliure de nucleases, per la qual cosa cal esbandir el dipòsit d'electroforesi, l'ampolla de sol, el suport de gel i pentinar amb aigua DEPC.L'agarosa també està lliure de nucleases (sempre que estigui acabada d'obrir), i el tampó de càrrega s'ha d'obrir el màxim possible, amb gel a l'1,2%.

Tingueu en compte que el gel s'ha de dissoldre completament, en cas contrari, provocarà bandes no homogènies, com es mostra a la mostra 9 de la figura.Si el voltatge és massa alt o funciona durant massa temps, generarà calor i provocarà la degradació de l'ARN, de manera que el voltatge i el temps s'han de controlar raonablement.A més, el funcionament del gel també pot determinar encara més si hi ha residus d'ADN a la mostra i observar si hi ha un gran nombre de bandes retingudes al pou de dispensació.

Figura.Electroforesi en gel detecció d'ARN

2 Esteu segur de la concentració del vostre ADNc?

L'experiència dels germans grans al laboratori és que l'ADNc del sistema de 20 ul obtingut per cada inversió es dilueix directament 20X, mentre que les germanes postdoctorals es dilueixen 10X.Normalment depenc de la situació.Com que la qualitat de l'ARN esmentada per cada persona és diferent, el nivell de reversió també és diferent i la tecnologia de reversió pot no ser estable.

Així, cada vegada que rebi l'ADNc invertit, primer el diluiré unes 3 vegades i després utilitzaré el gen de la neteja per fer RT-PCR, el nombre de cicles és generalment de 25 cicles, per identificar la concentració específica i, a continuació, determinar el factor de dilució final.

3 Esteu segur que les vostres imprimacions són fàcils d'utilitzar?

Pot passar la corba de fusió de qRT-PCR, però això encara costa diners.Per als laboratoris sense molts diners, quan obtenen molts primers, poden utilitzar RT-PCR normal per veure si es tracta d'una sola banda i identificar l'especificitat dels primers.Si el laboratori no té diners, l'especificitat de tots els primers es pot identificar una vegada a través de la corba de fusió.

4 Esteu segur que les vostres condicions experimentals són adequades?

SYBR s'ha de protegir de la llum forta, així que intenteu apagar la llum superior quan afegiu el reactiu SYBR i només cal que utilitzeu una llum tènue per completar-lo.

Emmagatzemar SYBR a 4 °C.Quan s'utilitzi, inverteixi suaument cap amunt i cap avall per barrejar bé per evitar l'escuma, i no vortexeu vigorosament.

A algunes germanes més petites els agrada dibuixar marques a la pissarra de PCR per por de barrejar les mostres, cosa que està malament.Com que és molt probable que els vostres marcadors afectin la col·lecció de senyals fluorescents, en general recomano als joves que utilitzin quaderns experimentals per ajudar a la memòria, tal com es mostra a continuació.

Figura.Diagrama de càrrega de mostra de qRT-PCR

5 Estàs segur que ho estàs fent bé?

Assegureu-vos de portar guants, utilitzar guants, utilitzar guants i dir coses importants tres vegades.

Per tal de reduir l'exposició de SYBR a la llum, personalment m'agrada afegir primer una plantilla, tal com es mostra a la figura següent.Segons l'experiència, és probable que l'addició d'una petita quantitat de plantilla provoqui errors de mostreig.Per tant, per tal de minimitzar l'error causat per l'addició d'una petita quantitat de plantilla, normalment torno a duplicar la mostra i duplicar la quantitat en afegir la mostra per reduir la quantitat d'H2O2 afegit.

Figura.Diagrama esquemàtic de càrrega de qRT-PCR

A continuació, configureu el sistema qRT-PCR de la següent manera.

Figura.Diagrama de preparació del sistema qRT-PCR

NOTA: El procés de configuració s'ha de fer sobre gel.

Després d'afegir la mostra, enganxeu la pel·lícula de segellat transparent.Intenteu no tocar la superfície de la pel·lícula de segellat transparent amb les mans, només ho feu des de l'espai a banda i banda de la pel·lícula.Perquè les empremtes dactilars també poden afectar la recollida de senyals fluorescents.A continuació, utilitzeu una centrífuga per centrifugar ràpidament durant 10 s a baixa velocitat per evitar que la mostra pengi a la paret.

Productes relacionats:

Kit Cell Direct RT-qPCR

RT Fàcil II