La COVID-19 és una malaltia infecciosa causada pel coronavirus tipus 2 de la síndrome respiratòria aguda severa. Quan una persona està infectada, els símptomes més comuns inclouen febre, tos i dificultat per respirar.
Les mostres utilitzades per a les proves es poden recollir amb hisops nasofaríngs o orofaríngs.
Què és la PCR?
El mètode estàndard de detecció de coronavirus és la reacció en cadena de la polimerasa, PCR.Aquest és un mètode molt utilitzat en biologia molecular.Pot copiar ràpidament milions a milers de milions de fragments d'ADN específics.
El nou coronavirus conté un genoma d'ARN monocatenari molt llarg.Per detectar aquests virus per PCR, les molècules d'ARN s'han de convertir en les seves seqüències d'ADN complementàries mitjançant la transcriptasa inversa, i després l'ADN recentment sintetitzat es pot amplificar mitjançant procediments estàndard de PCR, que es coneix comunament com RT-PCR.
Procés RT-PCR
Extracció d'ARN
Per dur a terme aquest mètode, bàsicament s'ha d'extreure l'ARN viral.Es poden utilitzar una varietat de kits de purificació d'ARN per a una separació còmoda, ràpida i eficaç.
Per extreure l'ARN viral mitjançant un kit comercial, primer afegiu la mostra a un tub de microcentrífuga i després barregeu-la amb el tampó de lisi.Aquest tampó està molt desnaturalitzat i normalment està format per fenol i isotiocianat de guanidina.A més, els inhibidors de la RNasa solen estar presents al tampó de lisi per garantir l'aïllament de l'ARN viral intacte.
Després d'afegir el tampó de lisi, agitar el tub de mescla per pols i incubar a temperatura ambient.A continuació, el virus es lisa en condicions altament desnaturalitzants proporcionades pel tampó de lisi.
Després de lisar la mostra, s'utilitza un tub de centrífuga per al procediment de purificació.La mostra es carrega al tub de centrífuga i després es centrifuga.
Aquest procediment és un mètode d'extracció en fase sòlida en què la fase estacionària consisteix en una matriu de gel de sílice.
En condicions òptimes de sal i pH, les molècules d'ARN s'uneixen a la membrana de sílice.
Al mateix temps, s'eliminen proteïnes i altres contaminants.
Després de la centrifugació, poseu el tub de centrífuga en un tub de recollida net, descarteu el filtrat i, a continuació, afegiu el tampó de rentat.
Col·loqueu de nou el tub a la centrífuga per forçar el tampó de rentat a través de la membrana.Això eliminarà totes les impureses restants de la membrana, deixant només l'ARN unit al gel de sílice.
Després de rentar la mostra, poseu el tub en un tub de microcentrífuga net i afegiu el tampó d'elució.
Després es centrifuga per forçar el tampó d'elució a través de la membrana.El tampó d'elució elimina l'ARN viral de la columna de spin i obté ARN purificat lliure de proteïnes, inhibidors i altres contaminants.
PAS 2
Concentrat mixt
Després d'extreure l'ARN viral, el següent pas és preparar la barreja de reacció per a l'amplificació per PCR.En aquest pas, s'utilitza concentrat.Aquesta solució concentrada és una solució concentrada premesclada que consta d'una premescla, transcriptasa inversa, nucleòtids, cebador directe, cebador invers, sonda TaqMan i ADN polimerasa.
Finalment, per completar aquesta barreja de reacció, s'afegeix la plantilla d'ARN.Els tubs es barregen mitjançant vòrtex de pols i després la barreja de reacció es carrega a la placa de PCR.La placa de PCR normalment conté 96 pous i pot analitzar diverses mostres alhora.
PAS 3
Amplificació per PCR
A continuació, col·loqueu la placa a la màquina de PCR, que és essencialment un termociclador.
La RT-PCR en temps real s'utilitza per detectar el nou coronavirus del 2019 mitjançant l'amplificació de la seqüència objectiu en el gen RdrRP, el gen E i el gen N.L'elecció del gen objectiu depèn de la seqüència de l'encebador i de la sonda.
El primer pas de la RT-PCR és la transcripció inversa.Es sintetitza la primera cadena d'ADN complementari, que s'inicia pel cebador invers de la PCR, que s'uneix a la part complementària del genoma de l'ARN viral.A continuació, la transcriptasa inversa afegeix nucleòtids d'ADN a l'extrem 3' de l'encebador per sintetitzar ADN complementari a l'ARN viral.La temperatura i la durada d'aquest pas depenen dels primers, l'ARN diana i la transcriptasa inversa utilitzats.
A continuació, s'aplica un pas inicial de desnaturalització, que resulta en la desnaturalització de l'híbrid ARN-ADN.Aquest pas és necessari per activar l'ADN polimerasa.Al mateix temps, la transcriptasa inversa està inactivada.
La PCR consta d'una sèrie de cicles tèrmics.Cada cicle consta d'etapes de desnaturalització, recuit i extensió.
El pas de desnaturalització consisteix a escalfar la cambra de reacció a 95 graus centígrads i utilitzar-la per a la desnaturalització de la plantilla d'ADN de doble cadena.
En el següent pas, la temperatura de reacció es redueix a 58 graus centígrads, permetent que l'encebador directe s'aconsegueixi a la part complementària de la seva plantilla d'ADN monocatenari.La temperatura de recuit depèn directament de la longitud i la composició de la imprimació.
En el pas d'extensió, l'ADN polimerasa sintetitza una nova cadena d'ADN que és complementària a la cadena de plantilla d'ADN.Afegint nuclis lliures complementaris a la plantilla en la direcció 5'a 3' de la barreja de reacció.La temperatura d'aquest pas depèn de l'ADN polimerasa utilitzada.
Després del primer cicle, s'obté una diana d'ADN de doble cadena.
A continuació, entreu al segon cicle.L'ADN de doble cadena es desnaturalitza per produir dues molècules d'ADN monocatenari.
En el següent pas, la temperatura de reacció es redueix, els cebadors s'apropen a cada plantilla d'ADN monocatenari i la sonda Taq-man es recua a la part complementària de l'ADN objectiu.
La sonda TaqMan consisteix en un fluoròfor lligat covalentment a l'extrem 5' de la sonda oligonucleòtid.Quan és excitat per la font de llum del ciclador, el fluoròfor emet fluorescència.A més, la sonda es compon d'un extintor a l'extrem 3'.La proximitat del gen reporter al quencher impedeix la detecció de fluorescència.
En el pas d'extensió, l'ADN polimerasa sintetitza una nova cadena.Quan la polimerasa arriba a la sonda TaqMan, la seva activitat endògena 5′nucleasa escinda la sonda, separant el colorant de l'extinc.
Amb cada cicle de PCR, s'alliberen més molècules de colorant, donant lloc a un augment de la intensitat de fluorescència proporcional al nombre d'amplicons sintetitzats.
Aquest mètode permet estimar el nombre d'una seqüència donada present a la mostra.El nombre de fragments d'ADN de doble cadena es duplica en cada cicle.Per tant, la PCR es pot utilitzar per analitzar mostres molt petites.
Per mesurar el senyal fluorescent, la làmpada halògena de tungstè, el filtre d'excitació, el reflector, la lent, el filtre d'emissió i la càmera CCD amb dispositiu acoblat amb càrrega.
PAS 4 Detectar
Per mesurar el senyal fluorescent, la làmpada halògena de tungstè, el filtre d'excitació, el reflector, la lent, el filtre d'emissió i la càmera CCD amb dispositiu acoblat amb càrrega.
La llum filtrada de la làmpada és reflectida pel reflector, passa a través de la lent del condensador i s'enfoca al centre de cada forat.Aleshores, la fluorescència emesa pel forat es reflecteix pel mirall, passa pel filtre d'emissió i és detectada per la càmera CCD.En cada cicle de PCR, el CCD pot detectar la llum fluoròfor autoexcitada.
Converteix la llum captada en dades digitals.Aquest mètode s'anomena PCR en temps real i permet un seguiment en temps real del progrés de la reacció de PCR.
Hora de publicació: 19-jul-2021
