PCR, múltiples PCR, PCR in situ, PCR inversa, RT-PCR, qPCR（1）–PCR

Ordenarem els conceptes, passos i detalls de diversos PCR

Ⅰ. PCR

La reacció en cadena de la polimerasa, anomenada PCR, és una tecnologia biològica molecular que s'utilitza per augmentar fragments d'ADN específics.Es pot considerar com una replicació especial de l'ADN in vitro.L'ADN polimerasa (ADN polimerasa I) es va descobrir ja l'any 1955, i el Dr. H. Klenow va descobrir el fragment de Klenow d'E. Coli, que té valor experimental i practicitat, a principis dels anys 70, però com que aquest enzim no tolera la temperatura, la temperatura alta pot degenerar-la, per la qual cosa no compleix la reacció de la polimerasa amb alta temperatura.Els enzims que s'utilitzen avui dia (anomenats Taq polimerasa), es van aïllar de Thermus aquaticus, un bacteri d'aigües termals l'any 1976. La seva característica és que pot resistir altes temperatures i és un enzim ideal, però s'utilitza àmpliament després dels anys vuitanta.El concepte original del prototip primitiu original de PCR és similar a la reparació i còpia de gens, que va ser proposat pel Dr. KJell Kleppe l'any 1971. Va publicar la primera còpia gènica simple i a curt termini (similar a les dues primeres reaccions de cicle de PCR).El PCR desenvolupat avui va ser desenvolupat pel Dr. Kary B. Mullis l'any 1983. El Dr. Mullis va servir a empreses de PE aquell any, de manera que PE té un estatus especial en la indústria de la PCR.El Dr. Mullis va publicar oficialment el primer article relacionat amb Saiki i altres l'any 1985. Des de llavors, l'ús de la PCR és de milers de quilòmetres al dia, i es pot dir que la qualitat dels articles relacionats fa que molts altres mètodes d'investigació siguin desagradables.Posteriorment, la tecnologia PCR s'utilitza àmpliament en la investigació científica biològica i les aplicacions clíniques, convertint-se en la tecnologia més important de la investigació en biologia molecular.Mullis també va guanyar el Premi Nobel de Química l'any 1993.

PCRPrincipi

El principi bàsic de la tecnologia de PCR és similar al procés de replicació natural de l'ADN, i la seva especificitat depèn de l'encebador oligonucleòtid que és complementari als dos extrems de la seqüència diana.La PCR es compon de tres passos de reaccions bàsiques de degeneració-recuit: ①Degeneració de l'ADN plantilla: després d'escalfar l'ADN plantilla a uns 93 °C durant un període de temps determinat, la solució d'ADN dual per a l'ADN de cadena dual format per l'amplificació de PCR de l'ADN plantilla Sortint, fa que es pugui combinar una única cadena amb la següent reacció per preparar la reacció.②El recuit (compost) de l'ADN plantilla i el cebador: després d'escalfar l'ADN de plantilla i degenerar en una única cadena, la temperatura baixa a uns 55 °C.La seqüència complementària de l'encebador i la plantilla d'ADN monocadena.③L'extensió del cebador: plantilla d'ADN: la unió del cebador es basa en l'acció de la polimerasa TaqDNA, amb dNTP com a matèria primera de reacció.Mantingueu el principi de replicació, sintetitzeu una nova cadena de còpies semi-reservada que complementi la cadena d'ADN de plantilla i repetiu el cicle degeneració-recuit-extensió tres processos poden obtenir més "cadenes de còpies semi-reservades", i aquesta nova cadena està disponible de nou. Convertiu-vos en una plantilla per al proper cicle.Es triga 2-4 minuts a completar el bucle, el gen objectiu es pot amplificar diversos milions de vegades en 2-3 hores.

EstàndardPCRSistema de reacció

Cinc elements de la reacció de PCR

Hi ha principalment cinc tipus de substàncies implicades en la reacció de PCR, a saber, cebador, enzim, dNTP, plantilla i tampó (es requereix Mg2+).[Procediment de PCR]

El procés estàndard de PCR es divideix en tres passos

1. Degeneració de l'ADN (90°C-96°C): Plantilles d'ADN de cadena dual sota acció tèrmica, es trenquen els ponts d'hidrogen, formant un ADN d'una sola cadena.

2. Recuit (25℃ -65℃): la temperatura del sistema es redueix, el cebador es combina amb la plantilla d'ADN per formar una cadena dual local.

3. Extensió (70℃ -75℃): Sota l'acció de l'enzim Taq (uns 72 °C, la millor activitat), dNTP s'utilitza com a matèria primera, s'estén des de l'extrem 5′ de l'imprimació → extrem 3′, la síntesi i la plantilla es complementen entre si.

Cada cicle és desnaturalitzat, recuit i allargat, duplicant el contingut d'ADN.Actualment, a causa de la curta àrea d'amplificació, algunes PCR es poden replicar en molt poc temps encara que l'activitat de l'enzim Taq no sigui òptima, de manera que es pot canviar a dos passos, és a dir, el recuit i l'extensió es poden realitzar a 60 °C-65 °C alhora.Per tal de reduir el procés d'elevació i refrigeració i millorar la velocitat de resposta.

Característiques de la reacció PCR

● Alta especificitat

Els factors decisius específics de la resposta PCR són: ①La combinació específica de l'encebador i l'ADN plantilla.②El principi de l'aparellament de bases.③La lleialtat de la reacció de síntesi de la polimerasa TaqDNA.④L'especificitat i conservació del gen objectiu.

La combinació correcta de primers i plantilles és la clau.La unió de l'imprimació i la plantilla i l'extensió de la cadena d'imprimació es basen en el principi d'adaptació de bases alcalines.La lleialtat de les reaccions de síntesi de la polimerasa i la resistència a alta temperatura de l'ADN polimerasa Taq per fer la unió (compost) de la plantilla i el cebador en la reacció es poden realitzar a una temperatura més alta.L'especificitat de la combinació augmenta molt.El clip pot mantenir un alt grau de correcció.En seleccionar una regió genètica objectiu amb una alta conservació i una alta conservació, la seva especificitat és més alta.

● Alta sensibilitat

El volum de producció de productes de PCR augmenta per índex, que pot ampliar la plantilla inicial de Picker (PG = 10-12) per augmentar el nivell de microcontrolador fins al nivell de micrograms (μg = -6).Es poden detectar cèl·lules diana a partir d'1 milió de cèl·lules;en la detecció de virus, la sensibilitat de la PCR pot arribar a 3 RFU (unitats formades per punts buits);la taxa de detecció mínima en ciència bacteriana és de 3 bacteris.

● Simple i ràpid

La reflexió per PCR utilitza una ADN polimerasa Taq d'alta temperatura, que afegeix la solució de reacció alhora, és a dir, una reacció de degeneració-extensió de recuit a la solució d'amplificació d'ADN i a l'olla de bany d'aigua.Generalment, la reacció d'amplificació es completa en 2 a 4 hores.Els productes augmentats generalment s'analitzen mitjançant una espasa elèctrica i no han d'utilitzar isòtops, no hi ha contaminació radioactiva i una promoció fàcil.

● La puresa de la mostra és baixa

No cal separar virus o bacteris i cultiu de cèl·lules.Els productes bruts d'ADN i l'ARN es poden utilitzar com a amplificadors.La detecció d'amplificació d'ADN es pot utilitzar directament mitjançant mostres clíniques com ara sang, líquid corporal, líquid de rentat per a la tos, cabell, cèl·lules i teixit viu.

PCRproblemes comuns

● Fals negatiu, sense bandes amplificades

Les etapes clau de la reacció PCR inclouen: ① preparació d'àcids nucleics de plantilla, ② qualitat i especificitat dels cebadors, ③ la qualitat dels enzims ④ condicions del cicle de PCR.Trobar el motiu també s'ha d'analitzar i estudiar per als enllaços anteriors.

Plantilles: ① La plantilla conté proteïnes diverses, ② La plantilla conté un inhibidor de l'enzim Taq, ③ La proteïna de la plantilla no s'elimina, especialment la proteïna del grup del cromosoma.⑤ La degeneració de l'àcid nucleic desminer no és completa.Quan la qualitat dels enzims i els primers és bona, no hi ha cap banda d'amplificació, que és molt probable que sigui el tractament digestiu de les mostres.Hi ha alguna cosa malament amb el procés d'extracció d'àcids nucleics de la plantilla, de manera que per preparar una solució de digestió eficaç i estable, el seu procediment s'ha de fixar i no canviar arbitràriament.

Inactivació enzimàtica: s'ha d'utilitzar conjuntament un enzim nou o enzims antics i nous per analitzar si l'activitat de l'enzim es perd o és insuficient, donant lloc a falsos negatius.Cal tenir en compte que de vegades s'oblida l'enzim Taq o el bromur d'etidi.

Primer: la qualitat de la imprimació, la concentració de la imprimació i si la concentració dels dos imprimadors és simètrica.És un motiu comú de la fallada de la PCR o la banda creixent no és ideal i propensa a la difusió.Hi ha problemes amb la qualitat de les imprimacions d'alguns números de lot.Els dos primers tenen una concentració alta i una concentració baixa, provocant una amplificació asimètrica de baixa eficiència.Les contramesures són: ① Seleccioneu una bona imprimació per sintetitzar unitats.② La concentració de la imprimació no només depèn del valor OD, sinó que també presta atenció al líquid original de la imprimació per fer electroforesi en gel de sucre d'agar.Hi ha d'haver una zona de tira d'imprimació i la brillantor de les dues imprimacions ha de ser generalment consistent.Belt, la PCR pot fallar en aquest moment i s'hauria de resoldre amb la unitat de síntesi d'imprimació.Si una imprimació és alta, la brillantor és baixa i la seva concentració s'ha d'equilibrar quan es dilueix.③ L'imprimació s'ha de pagar i emmagatzemar a una concentració elevada per evitar la congelació múltiple o les peces de refrigeració a llarg termini de la nevera, cosa que farà que l'imprimació es deteriori i es degradi.④ El disseny de la imprimació no és raonable, com ara que la longitud de la imprimació és insuficient i el di cluster es forma entre els imprimadors.

Mg2 + concentració: la concentració d'ions Mg2 + té un gran impacte en l'eficiència de l'amplificació de PCR.Una concentració excessiva pot reduir el sexe oposat de l'amplificació per PCR.Si la concentració és massa baixa, la sortida de l'amplificació de la PCR fins i tot farà que l'amplificació de la PCR falli sense la banda d'expansió.

Canvi de volum de reacció: el volum utilitzat en l'amplificació de PCR és de 20ul, 30ul i 50ul o 100ul, el gran volum de l'aplicació per a l'amplificació de PCR s'estableix segons diferents propòsits de recerca científica i proves clíniques.Després de fer volums petits com 20 ul, cal condicionar el cordó en fer la mida, en cas contrari fallarà.

Raons físiques: la transformació és molt important per a l'amplificació per PCR.Si la temperatura de degeneració és baixa, el temps de degeneració és curt, és probable que es produeixi en falsos negatius;una temperatura de recuit massa baixa pot provocar una amplificació no específica i reduir l'eficiència de l'amplificació específica.Afecta molt la combinació d'encebadors i plantilles per reduir l'eficiència de l'amplificació de PCR.De vegades és necessari utilitzar termòmetres estàndard per detectar la variabilitat, el recuit i la temperatura estesa a la cuina d'extensió o soluble en aigua, que és un dels motius de la fallada de la PCR.

Variants de la seqüència diana: Si es produeix la seqüència diana, una mutació o supressió, la combinació del prototip i la plantilla es combina, o a causa de la manca de seqüència diana, el cebador i la plantilla perdran la seqüència complementària, i la seva amplificació per PCR no tindrà èxit.

● Fals positiu

La banda d'amplificació de PCR sembla coherent amb la banda de la seqüència objectiu i, de vegades, la seva banda és més ordenada i més alta.

El disseny del primer no és adequat: la seqüència d'amplificació seleccionada i la seqüència d'amplificació sense finalitat són homòlogues, de manera que quan s'amplifica per PCR, els productes de PCR amplificats són seqüències sense finalitat.La seqüència diana és massa curta o l'encebador és massa curt, i és propens a falsos positius.Cal redissenyar.

Contaminació creuada de la seqüència diana o dels productes d'amplificació: hi ha dues raons per a aquesta contaminació: En primer lloc, la contaminació creuada de tot el genoma o de grans segments, que condueix a falsos positius.Aquest tipus de fals positiu es pot resoldre mitjançant els mètodes següents: Aneu amb compte i suau durant l'operació per evitar que la seqüència objectiu s'inhala a la pistola de mostra o esquiqui fora del tub centrífug.Excepte els enzims i les substàncies que no poden suportar altes temperatures, tots els reactius o equips s'han de desinfectar amb alta pressió.Les canonades centrífugues i les mostres s'han d'utilitzar alhora.Quan cal, abans d'afegir mostres, el tub de reacció i el reactiu s'exposen als raigs ultraviolats per destruir l'àcid nucleic existent.En segon lloc, petits fragments de la contaminació atmosfèrica.Aquests petits fragments són més curts que la seqüència diana, però tenen una certa homologia.Es poden empalmar entre si.Després de complementar els primers, el producte de PCR es pot expandir, cosa que provocarà una producció de falsos positius.Es pot utilitzar per reduir o eliminar el mètode de PCR de niu.

● Apareix banda d'amplificació inespecífica

Les bandes que van aparèixer després de l'amplificació per PCR són incompatibles amb la mida esperada, o grans o petites, o alhora, o al mateix temps, bandes d'amplificació específiques i bandes d'amplificació no específiques.L'aparició de bandes inespecífiques és: En primer lloc, els cebadors són complementaris incomplets a la seqüència diana, o la polimerització de l'encebador per formar un di cluster.La segona és que la concentració d'ions MG2 + és massa alta, la temperatura de recuit és massa baixa i el nombre de cicles de PCR està relacionat.En segon lloc, la qualitat i la quantitat d'enzims.Sovint, els enzims d'algunes fonts són propensos a bandes no especials i els enzims de l'altra font no es produeixen.De vegades també es produeix una amplificació inespecífica dels enzims.Les contramesures són: redissenyar atractius si cal.Reduir la quantitat d'enzim o substituir l'enzim d'una altra font.Reduïu la quantitat de primària, augmenteu la quantitat de plantilles adequadament i reduïu el nombre de cicles.Augmenteu correctament la temperatura de recuit o utilitzeu el mètode de dos punts de temperatura (degeneració de 93 °C, recuit i estenent-se a uns 65 °C).

● Apareix estopa escamosa o cinta adhesiva

De vegades sembla que l'amplificació per PCR s'aplica o s'aplica o s'aplica un cinturó semblant a una catifa.Per això, a causa de la quantitat excessiva d'enzims o la mala qualitat de l'enzim, la concentració de dNTP és massa alta, la concentració de Mg2+ és massa alta, la temperatura de recuit és massa baixa i el nombre de cicles és massa.Les contramesures són: ①Reduir la quantitat d'enzims o canviar l'enzim d'una altra font.②Reduir la concentració de dNTP ③Reduir correctament la concentració de Mg2+.④ Augmenta la quantitat de plantilles i redueix el nombre de cicles.

Productes relacionats

PCR Heroᵀᴹ (amb colorant)

◮ Major fidelitat: 6 vegades la de l'enzim Taq normal;

◮ Velocitat d'amplificació més ràpida

◮ Més adaptabilitat de plantilles

◮ Major eficiència d'amplificació

◮ La tolerància ambiental és més forta: col·locat a 37 °C durant una setmana, mantenint més del 90% d'activitat;

◮ Té activitat DNA polimerasa 5'→3' i activitat exonucleasa 5'→3', sense activitat exonucleasa 3'→5'.

PCR Easyᵀᴹ (amb colorant)

El sistema de reacció únic i l'ADN polimerasa Taq d'alta eficiència fan que la reacció de PCR tingui una major eficiència, especificitat i sensibilitat d'amplificació.

RT-qPCR Easyᵀᴹ (One Step)-SYBR Green I

◮ El kit d'un sol pas fa que la transcripció inversa i la qPCR hi hagi dues reaccions al mateix tub, només cal afegir ARN plantilla, cebadors de PCR específics i ddH lliure de RNasa₂O.

◮ El kit pot analitzar quantitativament de manera ràpida i eficient l'ARN viral o traçar l'ARN.

◮ El kit utilitza un reactiu de transcripció inversa Foregene únic i Foregene HotStar Taq DNA Polymerase combinat amb un sistema de reacció únic per millorar eficaçment l'eficiència d'amplificació i l'especificitat de la reacció.

◮ El sistema de reacció optimitzat fa que la reacció tingui una sensibilitat de detecció més alta, una estabilitat tèrmica més forta i una millor tolerància.

◮ RT-qPCR fàcil^TM(One Step)-El kit SYBR Green I inclou un colorant de referència interna ROX, que es pot utilitzar per eliminar el senyal de fons i els errors de senyal entre pous, cosa que és convenient que els clients l'utilitzin en diferents models d'instruments quantitatius de PCR.

RT Fàcil^TMII (Premescla mestra per síntesi d'ADNc de la primera cadena perPCR en temps real)

-Capacitat eficient per eliminar gDNA, que pot eliminar gDNA de la plantilla en 2 minuts.

-Sistema de transcripció inversa eficaç, només triguen 15 minuts a completar la síntesi de la primera cadena d'ADNc.

-Plantilles complexes: les plantilles amb un alt contingut de GC i una estructura secundària complexa també es poden revertir amb alta eficiència.

-Sistema de transcripció inversa d'alta sensibilitat, les plantilles de nivell pg també poden obtenir ADNc d'alta qualitat.

-El sistema de transcripció inversa té una alta estabilitat tèrmica, la temperatura de reacció òptima és de 42 ℃ i encara té un bon rendiment de transcripció inversa a 50 ℃.