La RT-qPCR és l'experiment bàsic de la biologia molecular i tothom n'ha d'estar familiaritzat.Inclou principalment tres passos: extracció d'ARN, transcripció inversa a ADNc i PCR quantitativa fluorescent en temps real.No ajuda, què està passant?És probable que hi hagi un problema ambl'experiment de transcripció inversa!Tot i que sembla que l'experiment de transcripció inversa només necessita afegir ARN, dNTP, cebadors itranscriptasa inversaal tub de la centrífuga i barrejar bé, però en el procés de funcionament real, encara hi ha molts detalls als quals cal prestar atenció.Aprenem-ne!

Com jutjar la qualitat de l'ARN?
Per obtenir l'ADNc, la qualitat de l'ARN és fonamental!La qualitat de l'ARN es pot detectar principalment des de dos aspectes:
(1) Integritat de l'ARN:La integritat de l'ARN es pot verificar mitjançant electroforesi en gel d'agarosa. Prenent com a exemple eucariotes, l'ARN total complet té tres bandes clares, els pesos moleculars de gran a petit són 28S, 18S i 5S, i 28S és el doble de brillant que 18S;si es poden veure tres bandes, però el tipus de banda està borrosa o la difusió significa que l'ARN està parcialment degradat.En aquest moment, si us plau, realitzeu la reacció de transcripció inversa immediatament i augmenteu l'entrada de plantilla adequadament;si només es pot veure una banda amb un pes molecular petit o cap banda, l'ARN s'ha degradat completament i s'ha de tornar a extreure.Agilent 2100 indica la integritat de l'ARN amb el diagrama de pics i el valor RIN.Si l'àcid nucleic està intacte, la línia de base de l'electroferograma és plana;si l'àcid nucleic està molt degradat, la línia de base és desigual i apareixen més pics de degradació;el valor de RIN reflecteix la integritat de l'ARN, dins del rang de 0-10, com més gran sigui el valor, millor serà la qualitat de l'ARN.Bé, com més gran sigui el grau de completitud.
(2) Puresa de l'ARN:La relació de OD260/280 es pot detectar mitjançant espectrofotometria UV.Si la relació de OD260/280 està entre 1,9 i 2,1, la puresa és molt bona.
L'ADN genòmic residual pot conduir a resultats quantitatius inexactes
Quan s'extreu l'ARN, l'ARN que obtenim es pot barrejar amb ADN genòmic (gDNA) que no s'ha netejat.Per tant, l'ADNc després de la transcripció inversa també es barrejarà ambgDNA.Durant el riu avallqPCRreacció,cDNAi el gDNA es pot amplificar simultàniament, donant lloc a un valor CT relativament petit, de manera que els resultats poden estar esbiaixats.
Aleshores, què hem de fer en aquesta situació?Foregenesuggereix:
(1) Realitzeu la neteja del genoma a l'ARN invertit, que es pot eliminar mitjançant l'extracció de columna durant l'extracció d'ARN;
(2) Tracteu l'ARN extret amb DNasaI , però acabeu-lo amb EDTA;
de reactius de transcripció inversaamb mòduls de neteja del genoma;

Com triar primers per a la transcripció inversa?
Els cebadors de transcripció inversa també afecten el resultat de la reacció de transcripció inversa.Podeu triar cebadors aleatoris, Oligo dT o cebadors específics de gens per a la transcripció inversa segons les circumstàncies específiques de l'experiment:
(1) Transcripcions específiques: es recomanen cebadors específics de gens;
(2) Transcripcions de fragments llargs: Es recomanen cebadors d'Oligo dT/gen específics;
(3) Fragments interns de transcripcions de segment llarg: cebadors específics del gen/ cebadors aleatoris / cebadors aleatoris + Oligo dT.Si es realitza l'experiment de qPCR posterior, l'Oligo dT no es pot utilitzar sol, perquè l'ús d'Oligo dT sol pot provocar un biaix final 3′, donant lloc a resultats de l'experiment de qPCR inexactes;
(4) miRNA: Es poden utilitzar imprimadors de bucle de tija o imprimadors de cua.

Quantes vegades s'ha de diluir l'ADNc del producte de transcripció inversa per a la quantificació?
Després d'obtenir l'ADNc del producte de transcripció inversa, quantes vegades s'ha de diluir l'ADNc per als experiments de qPCR és molt important.Si la concentració d'ADNc és massa alta o massa baixa, l'eficiència d'amplificació es pot veure afectada.Es pot mesurar la concentració d'ADNc i com s'ha de fer?
(1) La concentració d'ADNc del producte de transcripció inversa no es pot mesurar, perquè a més del producte de transcripció inversa, el producte de transcripció inversa també conté tampó residual de transcripció inversa, transcriptasa inversa, cebadors, etc., que interferirà amb els resultats de la mesura de la concentració i provocarà una relació OD260/280, OD260/230 i, per tant, no reflecteix la relació cDNA anormal.En aquest moment, alguns amics diran, després mesuraré la concentració després de la purificació;aquí, Foregene vol recordar que no es recomana purificar l'ADNc, perquè la longitud de l'ADNc obtingut per la reversió és diferent i l'ADNc curt es perdrà en la purificació.
(2) Què fer?Abans de l'experiment de qPCR, el gradient de dilució de l'ADNc es pot determinar mitjançant el pre-experiment.Per exemple: utilitzeu una solució d'emmagatzematge d'ADNc, una dilució de 10 vegades i una dilució de 100 vegades com a plantilles per a experiments de qPCR i seleccioneu el factor de dilució amb un valor CT en el rang de 18-28.

Com s'han de transcriure inversament els miRNA?
El miRNA és un ARN de molècula petita d'una sola cadena amb una mida d'uns 22 nt que no codifica proteïnes.A causa de la seva curta durada, el mètode qPCR convencional és difícil de quantificar-lo directament, per la qual cosa sovint és necessari estendre el miRNA;els mètodes de transcripció inversa utilitzats habitualment per a miRNA inclouen el mètode de bucle de tija i el mètode de cua.
El mètode stem-loop és estendre el miRNA afegint cebadors stem-loop.Aquest mètode de detecció té més sensibilitat i especificitat, però el rendiment de detecció és baix.Una transcripció inversa només pot detectar un miRNA i una referència interna;el mètode d'addició de la cua es compon de dos Es completa amb l'acció conjunta de dos enzims, que són la PoliA polimerasa i la transcriptasa inversa.La polimerasa PolyA és responsable d'afegir cues de PolyA al miRNA per augmentar la seva longitud, i la transcriptasa inversa realitza la reacció de transcripció inversa.Aquest mètode té un alt rendiment de detecció i pot detectar múltiples miRNAs i referències internes en una transcripció inversa, però la sensibilitat i l'especificitat són baixes en el mètode stem-loop.