Diversos invents revolucionaris en la història de la tecnologia de detecció al meu cap són la tecnologia d'immunoetiquetatge basada en el principi d'unió específica antigen-anticossos, tecnologia de PCR i tecnologia de seqüenciació.Avui parlarem de la tecnologia PCR.Segons l'evolució de la tecnologia PCR, la gent habitualment divideix la tecnologia PCR en tres generacions: tecnologia PCR ordinària, tecnologia PCR quantitativa fluorescent en temps real i tecnologia PCR digital.
Ctècnica comuna de PCR
KARY MULLIS (28.12.1944-7.8.2019)
Kary Mullis va inventar la reacció en cadena de la polimerasa (reacció en cadena de la polimerasa, PCR) l'any 1983. Es diu que quan conduïa la seva xicota, de sobte va tenir un llampec d'inspiració i va pensar en el principi de la PCR (sobre els beneficis de conduir).Kary Mullis va rebre el Premi Nobel de Química l'any 1993. El New York Times va comentar: "Altament original i significatiu, gairebé dividint la biologia en èpoques pre-PCR i post-PCR.
El principi de la PCR: Sota la catàlisi de l'ADN polimerasa, l'ADN de la cadena mare s'utilitza com a plantilla i l'imprimació específica s'utilitza com a punt de partida d'extensió, i l'ADN de la cadena filla complementari a l'ADN de la cadena mare es copia in vitro mitjançant desnaturalització, recuit, extensió i altres passos.És una tecnologia d'amplificació de síntesi d'ADN in vitro, que pot amplificar de manera ràpida i específica qualsevol ADN objectiu in vitro.
Avantatges de la PCR ordinària
1.Mètode clàssic, estàndards nacionals i internacionals complets
2.Menor cost dels reactius de l'instrument
3.Els productes de PCR es poden recuperar per a altres experiments de biologia molecular
Màquina de PCR Foregene recomanada: https://www.foreivd.com/foreamp-sn-695-series-thermal-cycler-96-wells-pcr-machine-product/
Productes relacionats: https://www.foreivd.com/pcr-herotm-with-dye-product/
Inconvenients de la PCR ordinària
1.fàcil de contaminar
2.operació feixuga
3.només anàlisi qualitativa
4.Sensibilitat moderada
5.Hi ha una amplificació inespecífica, i quan la banda no específica té la mateixa mida que la banda objectiu, no es pot distingir
CPCR basada en electroforesi apil·lar
Com a resposta a les deficiències de la PCR ordinària, alguns fabricants han introduït instruments basats en el principi de l'electroforesi capil·lar.El pas d'electroforesi després de l'amplificació per PCR es completa al capil·lar.La sensibilitat és més alta, es pot distingir la diferència de diverses bases i l'amplificació es pot calcular per MAERKER.contingut del producte.El desavantatge és que el producte de PCR encara s'ha d'obrir i posar a l'instrument, i encara hi ha un gran risc de contaminació.
Capil·larEelectroforesi
2. Tecnologia de PCR quantitativa fluorescent en temps real (PCR quantitativa en temps real, qPCR)La PCR quantitativa fluorescent, també anomenada PCR en temps real, és una nova tecnologia quantitativa d'àcids nucleics desenvolupada per PE (Perkin Elmer) l'any 1995. La història del desenvolupament de la PCR quantitativa fluorescent és una història de lluites de gegants com ABI, Roche i Bio-Rad.Si esteu interessats, podeu consultar-ho.Aquesta tècnica és actualment la tècnica de PCR semiquantitativa més madura i utilitzada.
Màquina qPCR recomanada: https://www.foreivd.com/mini-real-time-pcr-system-forequant-sf2sf4-product/
Mètode de tint fluorescent (SYBR Green I):SYBR Green I és el colorant d'unió a l'ADN més utilitzat per a la PCR quantitativa, que s'uneix de manera no específica a l'ADN de doble cadena.En estat lliure, SYBR Green emet una fluorescència feble, però un cop unit a l'ADN de doble cadena, la seva fluorescència augmenta 1000 vegades.Per tant, el senyal fluorescent total emès per una reacció és proporcional a la quantitat d'ADN de doble cadena present i augmentarà amb l'augment del producte amplificat.Com que el colorant s'uneix inespecíficament a l'ADN de doble cadena, es poden generar resultats falsos positius.
Productes relacionats: https://www.foreivd.com/real-time-pcr-easytm-sybr-green-i-kit-product/
Mètode de sonda fluorescent (tecnologia Taqman): DurantAmplificació per PCR, s'afegeix una sonda fluorescent específica al mateix temps que un parell d'encebadors.La sonda és un oligonucleòtid lineal, amb un grup informador fluorescent i un grup extintor fluorescent marcats respectivament als dos extrems.Quan la sonda està intacta, el senyal fluorescent emès pel grup informador és absorbit pel grup extintor i la detecció No hi ha senyal fluorescent;durant l'amplificació de PCR (en l'etapa d'extensió), l'activitat 5'-3' Dicer de l'enzim Taq digerirà i degradarà la sonda, de manera que el grup fluorescent reporter i el grup fluorescent extintor es separen, de manera que el sistema de control de la fluorescència es pot rebre el senyal fluorescent, és a dir, cada vegada que s'amplifica una cadena d'ADN, la molècula de sincronització s'acompleix del senyal fluorescent de sincronització completa. s i la formació de productes de PCR.El mètode de la sonda Taqman és el mètode de detecció més utilitzat en la detecció clínica.
Productes relacionats: https://www.foreivd.com/quickeasy%e1%b5%80%e1%b4%b9-real-time-pcr-kit-taqman-product/
Avantatges de la qPCR
1.El mètode està madur i l'equip de suport i els reactius estan complets
2.Cost mitjà dels reactius
3.fàcil d'usar
4.Alta sensibilitat i especificitat de detecció
Inconvenients de la qPCR
La mutació del gen objectiu condueix a la detecció perduda.
No es pot determinar el resultat de la detecció de la plantilla de baixa concentració.
Hi ha un gran error quan s'utilitza la corba estàndard per a la detecció quantitativa.
3. Tecnologia digital PCR (digital PCR, dPCR).
La PCR digital és una tècnica per a la quantificació absoluta de molècules d'àcid nucleic.En comparació amb la qPCR, la PCR digital pot llegir directament el nombre de molècules d'ADN/ARN, que és la quantificació absoluta de les molècules d'àcid nucleic a la mostra inicial.El 1999, Bert Vogelstein i Kenneth W. Kin-zler van proposar formalment el concepte de dPCR.
El 2006, Fluidigm va ser el primer a produir un instrument comercial dPCR basat en xips.El 2009, Life Technologies va llançar els sistemes dPCR OpenArray i QuantStudio 12K Flex.El 2013, Life Technologies va llançar el sistema QuantStudio 3DdPCR, que utilitza tecnologia de xips microfluídics a nanoescala d'alta densitat per distribuir uniformement mostres a 20.000 cèl·lules individuals.bé en la reacció.
El 2011, Bio-Rad va llançar l'instrument QX100 dPCR basat en gotes, que utilitza la tecnologia d'aigua en oli per distribuir uniformement la mostra a 20.000 gotes d'aigua en oli i utilitza un analitzador de gotes per analitzar les gotes.El 2012, RainDance va llançar l'instrument RainDrop dPCR, impulsat per gas d'alta pressió, per dividir cada sistema de reacció estàndard en una emulsió de reacció que conté entre 1 i 10 milions de microgotetes a nivell de picoliter.
Fins ara, la PCR digital ha format dues faccions principals, tipus xip i tipus gota.Independentment de quin tipus de PCR digital, els seus principis bàsics són la limitació de la dilució, la PCR final i la distribució de Poisson.El sistema de reacció de PCR estàndard que conté plantilles d'àcid nucleic es divideix uniformement en desenes de milers de reaccions de PCR, que es distribueixen a xips o microgotes, de manera que cada reacció conté tant com sigui possible una molècula de plantilla i es realitza una reacció de PCR de plantilla d'una sola molècula.Mitjançant la lectura de la fluorescència Es compta la presència o absència del senyal i es realitza la quantificació absoluta després del calibratge de la distribució estadística de Poisson.
Les següents són les característiques de diverses plataformes de PCR digital que he utilitzat:
1. Bio-Rad QX200 PCR digital de gotes Bio-RadQX200 és una plataforma de PCR digital molt clàssica, el procés de detecció bàsic: el generador de gotes genera 20.000 mostres. Les microgotes d'aigua en oli s'amplifiquen en una màquina de PCR normal i, finalment, el senyal de fluorescència de cada microgota es llegeix per un lector de microgotes.L'operació és més complicada, i el risc de contaminació és mitjà.
PCR digital de microgotes Xinyi TD1Xinyi TD1 és una plataforma de PCR digital domèstica, el procés de detecció bàsic: genera 30.000-50.000 gotes d'aigua en oli a través d'un generador de gotes, amplifica en un instrument de PCR comú i, finalment, passa El lector de gotetes llegeix el senyal fluorescent de cada gota.Tant la generació de gotes com la lectura en aquesta plataforma es realitzen en un xip dedicat amb baix risc de contaminació.
STILLA Naica PCR digital de xip de microgotesSTILLA Naica és una plataforma de PCR digital relativament nova.El procés bàsic de detecció és: afegir la solució de reacció al xip, posar el xip al sistema de generació i amplificació de microgotes i generar 30.000 microgotes.Escampeu al xip i s'ha completat l'amplificació de PCR al xip.A continuació, el xip amplificat es transfereix al sistema d'anàlisi de lectura de microgotes i es llegeix el senyal fluorescent fent fotografies.Com que tot el procés té lloc en un xip tancat, el risc de contaminació és baix.
4. PCR digital amb xip 3D ThermoFisher QuantStudio
ThermoFisher QuantStudio 3D és una altra plataforma clàssica de PCR digital basada en xips.El seu procés bàsic de detecció és: afegir la solució de reacció a l'escampador i repartir la solució de reacció uniformement al xip amb 20.000 micropous a través de l'escampador., poseu el xip a la màquina de PCR per amplificar i, finalment, poseu el xip al lector i feu una foto per llegir el senyal fluorescent.L'operació és relativament complicada i tot el procés es realitza en un xip tancat i el risc de contaminació és baix.
5. PCR digital amb xip JN MEDSYS Clarity
JN MEDSYS Clarity és una plataforma de PCR digital de tipus xip relativament nova.El seu procés bàsic de detecció és: afegir la solució de reacció a l'aplicador i repartir la solució de reacció uniformement en 10.000 tubs de PCR fixats al tub de PCR a través de l'aplicador.Al xip microporós, la solució de reacció entra al xip per acció capil·lar, i el tub de PCR amb el xip es col·loca a la màquina de PCR per a l'amplificació i, finalment, el xip es posa al lector per llegir el senyal fluorescent fent una foto.L'operació és més complicada.El risc de contaminació és baix.
Els paràmetres de cada plataforma de PCR digital es resumeixen de la següent manera:
Els indicadors d'avaluació de la plataforma de PCR digital són: el nombre d'unitats dividides, el nombre de canals fluorescents, la complexitat de funcionament i el risc de contaminació.Però el més important és la precisió de la detecció.Una manera d'avaluar les plataformes de PCR digitals és utilitzar diverses plataformes de PCR digitals per verificar-se mútuament, i una altra manera és utilitzar substàncies estàndard amb valors precisos.
Avantatges de la dPCR
1.Aconseguint la quantificació absoluta
2.Major sensibilitat i especificitat
3.Pot detectar mostres de còpia baixa
Inconvenients de la dPCR1. Equips i reactius cars 2. Funcionament complicat i llarg temps de detecció 3. Interval de detecció estret
Actualment, les tres generacions de tecnologia PCR tenen els seus propis avantatges i desavantatges, i cadascuna té els seus propis camps d'aplicació, i no és una relació que una generació substitueixi l'altra.L'avenç continu de la tecnologia ha injectat una nova vitalitat a la tecnologia de PCR, que li permet desbloquejar una direcció d'aplicació rere l'altra, fent que la detecció d'àcids nucleics sigui més còmoda i precisa.
Font: el Dr. Yuan us porta a fer proves
Productes recomanats:
Hora de publicació: 18-nov-2022
