El valor Ct és la forma de presentació de resultats més important de la PCR quantitativa fluorescent.S'utilitza per calcular les diferències d'expressió gènica o el nombre de còpies gèniques.Aleshores, quin es considera raonable el valor Ct de la quantificació de la fluorescència?Com garantir el rang efectiu del valor Ct?
Què és el valor Ct?
Durant el procés d'amplificació qPCR, el nombre corresponent de cicles d'amplificació (Cycle Threshold) quan el senyal de fluorescència del producte amplificat arriba al llindar de fluorescència establert.C significa Cycle i T significa Llindar.En poques paraules, el valor Ct és el nombre de cicles corresponents a quan l'amplificació inicial de la plantilla arriba a una certa quantitat de producte en qPCR.L'anomenada "una certa quantitat de producte" s'explicarà més endavant.
Què fa el valor Ct?
1.Relació entre l'amplificació exponencial, la quantitat de plantilla i el valor Ct
Idealment, els gens de la qPCR s'acumulen per amplificació exponencial després d'un cert nombre de cicles.La relació entre el nombre de cicles d'amplificació i la quantitat de productes és: Quantitat de producte amplificat = quantitat inicial de plantilla × nombre de cicles (1+En).Tanmateix, la reacció qPCR no sempre es troba en una situació ideal.Quan la quantitat de producte amplificat arriba a una "certa quantitat de producte", el nombre de cicles en aquest moment és el valor Ct i es troba en el període d'amplificació exponencial.La relació entre el valor Ct i la quantitat de plantilla inicial: hi ha una relació lineal entre el valor Ct de la plantilla i el logaritme del número de còpia inicial de la plantilla.Com més gran sigui la concentració inicial de la plantilla, menor serà el valor de Ct;com més baixa sigui la concentració inicial de la plantilla, més gran serà el valor Ct.
2.Corba d'amplificació, llindar de fluorescència i certa quantitat de producte de PCR
La quantitat de producte d'amplificació qPCR es presenta directament en forma de senyal fluorescent, és a dir, la corba d'amplificació.A les primeres fases de la PCR, l'amplificació es troba en condicions ideals, el nombre de cicles és petit, l'acumulació de productes és petita i el nivell de fluorescència no es pot distingir clarament del fons de fluorescència.Després d'això, la fluorescència augmenta i entra a la fase exponencial.La quantitat de producte de PCR es pot detectar en un moment determinat quan la reacció de PCR es troba només en la fase exponencial, que es pot utilitzar com a "una certa quantitat de producte", i d'això es pot deduir el contingut inicial de la plantilla.Per tant, la intensitat del senyal de fluorescència corresponent a una certa quantitat de producte és el llindar de fluorescència.
A l'etapa tardana de la PCR, la corba d'amplificació ja no mostra amplificació exponencial i entra a la fase lineal i a la fase d'altiplà.
3.Reproducibilitat dels valors Ct
Quan el cicle de PCR arriba al número de cicle del valor Ct, acaba d'entrar en el període d'amplificació exponencial real.En aquest moment, el petit error no s'ha amplificat, de manera que la reproductibilitat del valor Ct és excel·lent, és a dir, la mateixa plantilla s'amplifica en diferents moments o en diferents tubs alhora.Amplificació, el valor Ct obtingut és constant.
1.Eficiència d'amplificació En
L'eficiència d'amplificació per PCR es refereix a l'eficiència amb què la polimerasa converteix el gen que s'ha d'amplificar en un amplicó.L'eficiència d'amplificació quan una molècula d'ADN es transforma en dues molècules d'ADN és del 100%.L'eficiència d'amplificació s'expressa habitualment com En.Per tal de facilitar l'anàlisi dels articles posteriors, s'introdueixen breument els factors que afecten l'eficiència de l'amplificació.
| Factors que influeixen | explicació | Com jutjar? |
| A. Inhibidors de la PCR | 1. L'ADN plantilla conté substàncies que inhibeixen la reacció de PCR, com ara proteïnes o detergents.2. L'ADNc després de la transcripció inversa conté una alta concentració de components d'ARN plantilla o reactius RT, que també poden inhibir la reacció de PCR posterior. | 1. Es pot jutjar si hi ha contaminació mesurant la relació entre A260/A280 i A260/A230 o electroforesi d'ARN.2. Si l'ADNc es dilueix segons una determinada proporció després de la transcripció inversa. |
| B. Disseny d'imprimació inadequat | Els imprimadors no recuit eficaçment | Comproveu les imprimacions per detectar dímers d'imprimació o forques, desajustos i, de vegades, dissenys intrònics. |
| C. Disseny inadequat del programa de reacció de PCR | 1. Els imprimadors no poden recuit eficaçment2. Alliberament insuficient d'ADN polimerasa 3. L'activitat de l'ADN polimerasa a alta temperatura a llarg termini va disminuir | 1. La temperatura de recuit és superior al valor TM de l'imprimació2. El temps de pre-desnaturalització és massa curt 3. El temps de cada etapa del procediment de reacció és massa llarg |
| D. Mescla insuficient de reactius o errors de pipeteig | En el sistema de reacció, la concentració local dels components de la reacció de PCR és massa alta o desigual, donant lloc a una amplificació no exponencial de l'amplificació de PCR. | |
| E. Longitud de l'amplicó | La longitud de l'amplicó és massa llarga, supera els 300 bp i l'eficiència d'amplificació és baixa | Comproveu que la longitud de l'amplicó estigui entre 80 i 300 bp |
| F. Influència dels reactius de qPCR | La concentració d'ADN polimerasa al reactiu és baixa o la concentració d'ions al tampó no està optimitzada, la qual cosa fa que l'activitat de l'enzim Taq no arribi al màxim. | Determinació de l'eficiència d'amplificació per corba estàndard |
2.Rang de valors Ct
Els valors de Ct oscil·len entre 15 i 35.Si el valor de Ct és inferior a 15, es considera que l'amplificació es troba dins del rang del període de referència i no s'ha arribat al llindar de fluorescència.Idealment, hi ha una relació lineal entre el valor Ct i el logaritme del número de còpia inicial de la plantilla, és a dir, la corba estàndard.A través de la corba estàndard, quan l'eficiència d'amplificació és del 100%, el valor Ct calculat per quantificar el nombre de còpia única del gen és al voltant de 35. Si és superior a 35, el número de còpia inicial de la plantilla és teòricament inferior a 1, cosa que es pot considerar sense sentit.
Per a diferents rangs de gens Ct, a causa de la diferència en el nombre de còpies del gen i l'eficiència d'amplificació en la quantitat inicial de plantilla, cal fer una corba estàndard per al gen i calcular l'interval de detecció lineal del gen.
3.Factors que influeixen en el valor Ct
A partir de la relació entre el nombre de cicles d'amplificació i la quantitat de producte: quantitat de producte amplificat = quantitat de plantilla inicial × (1 + En) número de cicle, es pot veure que en condicions ideals, la quantitat de plantilla inicial i En tindran un impacte negatiu en el valor Ct.La diferència en la qualitat de la plantilla o l'eficiència d'amplificació farà que el valor Ct sigui massa gran o massa petit.
El valor 4.Ct és massa gran o massa petit
Hora de publicació: 22-feb-2023
