La tecnologia de diagnòstic molecular utilitza mètodes de biologia molecular per detectar l'expressió i l'estructura del material genètic del cos humà i diversos patògens, per tal d'assolir el propòsit de predir i diagnosticar malalties.

En els darrers anys, amb l'actualització i la iteració de la tecnologia de diagnòstic molecular, l'aplicació clínica del diagnòstic molecular s'ha fet cada cop més extensa i en profunditat, i el mercat del diagnòstic molecular ha entrat en un període de ràpid desenvolupament.

L'autor resumeix les tecnologies de diagnòstic molecular comunes al mercat i es divideix en tres parts: la primera part presenta la tecnologia PCR, la segona part presenta la tecnologia d'amplificació isotèrmica d'àcids nucleics i la segona part presenta la tecnologia de seqüenciació.

01

Part I: Tecnologia PCR

Tecnologia PCR

La PCR (reacció en cadena de la polimerasa) és una de les tecnologies d'amplificació d'ADN in vitro, amb una història de més de 30 anys.

La tecnologia PCR va ser pionera l'any 1983 per Kary Mullis de Cetus, EUA.Mullis va sol·licitar una patent de PCR el 1985 i va publicar el primer article acadèmic de PCR sobre Science el mateix any.Mullis va guanyar el Premi Nobel de Química l'any 1993.

Principis bàsics de la PCR

La PCR pot amplificar fragments d'ADN objectiu més d'un milió de vegades.El principi és que sota la catàlisi de l'ADN polimerasa, l'ADN de la cadena pare s'utilitza com a plantilla i un cebador específic s'utilitza com a punt de partida per a l'extensió.Es replica in vitro mitjançant passos com la desnaturalització, el recuit i l'extensió.El procés de l'ADN de la cadena filla complementari a l'ADN plantilla de la cadena mare.

El procés estàndard de PCR es divideix en tres passos:

1. Desnaturalització: utilitzar alta temperatura per separar les cadenes dobles d'ADN.Els enllaços d'hidrogen entre les dobles cadenes d'ADN es trenquen a altes temperatures (93-98 °C).

2. Recuit: després de separar l'ADN de doble cadena, la temperatura es redueix perquè el cebador es pugui unir a l'ADN monocatenari.

3. Extensió: L'ADN polimerasa comença a sintetitzar cadenes complementàries al llarg de les cadenes d'ADN a partir dels cebadors units quan baixa la temperatura.Quan es completa l'extensió, es completa un cicle i el nombre de fragments d'ADN es duplica.

Al alternar aquests tres passos 25-35 vegades, el nombre de fragments d'ADN augmentarà exponencialment.

L'enginy de la PCR és que es poden dissenyar diferents cebadors per a diferents gens diana, de manera que els fragments del gen diana es poden amplificar en un curt període de temps.

Fins ara, la PCR es pot dividir en tres categories, a saber, PCR ordinària, PCR quantitativa fluorescent i PCR digital.

La primera generació de PCR ordinària

Utilitzeu un instrument d'amplificació PCR normal per amplificar el gen objectiu i, a continuació, utilitzeu l'electroforesi en gel d'agarosa per detectar el producte, només es pot fer una anàlisi qualitativa.

Els principals desavantatges de la PCR de primera generació:

-Propens a l'amplificació inespecífica i a resultats falsos positius.

-La detecció tarda molt de temps i el funcionament és feixuc.

- Només es poden fer proves qualitatives.

PCR quantitativa de fluorescència de segona generació

La PCR quantitativa de fluorescència (PCR en temps real), també coneguda com qPCR, s'utilitza per controlar l'acumulació de productes amplificats mitjançant l'acumulació de senyals fluorescents afegint sondes fluorescents que poden indicar el progrés del sistema de reacció i jutjar els resultats a través de la corba de fluorescència, i es pot quantificar amb l'ajuda del valor Cq i la corba estàndard.

Com que la tecnologia qPCR es porta a terme en un sistema tancat, la probabilitat de contaminació es redueix i el senyal de fluorescència es pot controlar per a la detecció quantitativa, de manera que és la més utilitzada en la pràctica clínica i s'ha convertit en la tecnologia dominant en PCR.

Les substàncies fluorescents utilitzades en la PCR quantitativa fluorescent en temps real es poden dividir en: sondes fluorescents TaqMan, balises moleculars i colorants fluorescents.

1) Sonda fluorescent TaqMan:

Durant l'amplificació per PCR, s'afegeix una sonda fluorescent específica mentre s'afegeix un parell d'encebadors.La sonda és un oligonucleòtid, i els dos extrems estan marcats respectivament amb un grup fluorescent reporter i un grup fluorescent extintor.

Quan la sonda està intacta, el senyal fluorescent emès pel grup informador és absorbit pel grup d'extinció;durant l'amplificació per PCR, l'activitat de l'exonucleasa 5'-3' de l'enzim Taq escinda i degrada la sonda, fent que el grup fluorescent reporter i l'extinció. El grup fluorescent es separa, de manera que el sistema de monitorització de la fluorescència pot rebre el senyal de fluorescència, és a dir, cada vegada que s'amplifica una cadena d'ADN, es forma una fluorescència i la formació de fluorescència es sincronitza completament amb la molècula. el producte PCR.

2) Colorants fluorescents SYBR:

En el sistema de reacció PCR, s'afegeix un excés de colorant fluorescent SYBR.Després que el colorant fluorescent SYBR s'incorpori de manera no específica a la doble cadena d'ADN, emet un senyal fluorescent.La molècula de colorant SYBR que no s'incorpora a la cadena no emetrà cap senyal fluorescent, assegurant així el senyal fluorescent. L'augment de productes de PCR està completament sincronitzat amb l'augment de productes de PCR.SYBR només s'uneix a l'ADN de doble cadena, de manera que la corba de fusió es pot utilitzar per determinar si la reacció de PCR és específica.

3) Balises moleculars

Es tracta d'una sonda d'oligonucleòtid de doble etiqueta amb bucle de tija que forma una estructura de forquilla d'unes 8 bases als extrems 5 i 3.Les seqüències d'àcids nucleics als dos extrems estan aparellades de manera complementària, fent que el grup fluorescent i el grup d'extinció estiguin ajustats.A prop, no produirà fluorescència.

Després de generar el producte de PCR, durant el procés de recuit, la part mitjana de la balisa molecular s'aparella amb una seqüència d'ADN específica i el gen fluorescent es separa del gen quencher per produir fluorescència.

Els principals desavantatges de la PCR de segona generació:

Encara falta sensibilitat i la detecció d'exemplars de poca còpia no és precisa.

Hi ha una influència del valor de fons i el resultat és susceptible d'interferències.

PCR digital de tercera generació

La PCR digital (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) calcula el número de còpia de la seqüència objectiu mitjançant la detecció del punt final i pot realitzar una detecció quantitativa absoluta precisa sense utilitzar controls interns i corbes estàndard.

La PCR digital utilitza la detecció del punt final i no depèn del valor Ct (llindar del cicle), de manera que la reacció de PCR digital es veu menys afectada per l'eficiència d'amplificació i es millora la tolerància als inhibidors de la reacció de PCR, amb una alta precisió i reproductibilitat.

A causa de les característiques d'alta sensibilitat i alta precisió, els inhibidors de la reacció de PCR no interfereixen fàcilment i pot aconseguir una quantificació absoluta sense productes estàndard, que s'ha convertit en un punt d'investigació i aplicació.

Segons les diferents formes de la unitat de reacció, es pot dividir en tres tipus: sistemes microfluídics, xips i gotes.