La PCR directa és una reacció que utilitza directament teixits animals o vegetals per a l'amplificació sense extracció d'àcids nucleics.En molts aspectes, la PCR directa funciona com la PCR normal

La diferència principal és el tampó personalitzat utilitzat en la PCR directa, la mostra es pot sotmetre directament a la reacció de PCR sense extracció d'àcid nucleic, però hi ha requisits corresponents per a la tolerància dels enzims i la compatibilitat del tampó implicat en la reacció de PCR directa.

Encara que hi ha més o menys inhibidors de la PCR en mostres comunes, la PCR directa encara pot aconseguir una amplificació fiable sota l'acció d'enzims i tampons.La reacció de PCR tradicional requereix àcid nucleic d'alta qualitat com a plantilla, que pot inhibir el progrés suau de la reacció de PCR si la plantilla conté proteïnes i altres impureses.La PCR directa és actualment una de les tecnologies més populars en el camp del diagnòstic molecular.

01 La PCR directa es va utilitzar originalment per a animals i plantes

La primera aplicació de la PCR directa es troba en el camp d'animals i plantes, com ara la sang, els teixits i els cabells de rata, gat, pollastre, conill, ovella, bestiar, etc., fulles i llavors de plantes, etc., utilitzats per estudiar el genotipat, transgènics, detecció de plasmidis, anàlisi de gens, identificació de fonts d'ADN, anàlisi d'espècies i altres camps d'identificació SNP.

Aquests camps tenen algunes característiques comunes, és a dir, el contingut del gen objectiu és relativament alt i l'extracció d'àcids nucleics és problemàtica, de manera que la PCR directa no només pot estalviar temps i tenir un petit impacte en els resultats, sinó que també estalvia costos.

La PCR directa utilitzada per a la detecció de patògens és una qüestió dels últims anys, alguns fabricants de reactius de PCR han fet molts esforços en aquesta direcció a l'hora de fer innovació.Especialment en aquesta epidèmia de COVID-19, molts d'aquests productes de detecció han aparegut al mercat, com el kit de detecció d'àcids nucleics SARS-CoV-2 (Multiplex PCR Fluorescent Probe Method) investigat i desenvolupat per Foregene, que utilitza la tecnologia RT PCR en temps real (rRT-PCR) per a la detecció qualitativa de mostres d'àcid nucleic naso-fànic humà o d'àcids nucleofànics SARS-CoV-2. s.

Foregene és una de les empreses que utilitzen la tecnologia Direct PCR, per a la detecció d'ORF1ab, N, E i normals.variant llinatges àcids nucleics en mostres d'hisop nasofarínge o orofarínge humà com el llinatge SARS-CoV-2 B.1.1.7 (Regne Unit), llinatge B.1.351 (ZA), llinatge B.1.617 (IND) i llinatge P.1 (BR).

02  Reactius necessaris per a la PCR directa

Lisat de mostra

El lisat de mostra es pot configurar o comprar.La diferència en la composició de diferents marques de lisat farà que la capacitat de lisat sigui diferent, i llavors el temps de lisat serà lleugerament diferent.Per exemple, per a la preparació de mostres de teixit animal, generalment es recomana una lisi de 30 minuts o durant la nit, i la solució de lisi per a virus oscil·la entre 3 i 10 minuts.

Mescla mestra de PCR

Es recomana utilitzar l'ADN polimerasa d'inici en calent per millorar l'amplificació específica i augmentar la capacitat d'amplificació.El nucli de la PCR directa és una polimerasa altament tolerant.

Eliminar o inhibir components de la mostra que afecten l'amplificació de l'ADN

Després de processar la mostra amb el lisat, s'alliberaran proteïnes, lípids i altres restes cel·lulars, aquestes substàncies inhibiran la reacció de PCR.Per tant, la PCR directa requereix l'addició de l'eliminació o inhibidors corresponents per reduir la influència d'aquests factors.

03  Una col·lecció de cinc punts de coneixement de la PCR directa

En primer lloc, la tecnologia de PCR directa és una tecnologia de PCR directa per a diverses mostres biològiques.Sota aquesta condició tècnica, no cal separar i extreure l'àcid nucleic, utilitzar directament la mostra de teixit com a objecte i afegir els cebadors del gen objectiu per dur a terme la reacció de PCR.

En segon lloc, la tecnologia de PCR directa no només és una tecnologia tradicional d'amplificació de plantilla d'ADN, sinó que també inclou PCR de transcripció inversa de plantilla d'ARN.

En tercer lloc, la tecnologia Direct PCR no només realitza directament reaccions de PCR qualitatives rutinàries en mostres de teixit, sinó que també inclou reaccions qPCR en temps real, que requereixen que el sistema de reacció tingui una forta capacitat d'interferència de fluorescència anti-fons i que la fluorescència endògena extingui la capacitat antagònica.

En quart lloc, les mostres dirigides per la tecnologia Direct PCR només necessiten l'alliberament de plantilles d'àcid nucleic i no eliminen proteïnes, polisacàrids, ions de sal, etc. que interfereixen amb la reacció de PCR.La qual cosa requereix que la polimerasa d'àcid nucleic i la barreja de PCR del sistema de reacció tinguin una excel·lent resistència i adaptabilitat per garantir l'activitat enzimàtica i la precisió de replicació en condicions complexes.

En cinquè lloc, la mostra de teixit dirigida per la tecnologia Direct PCR sense cap tractament d'enriquiment d'àcid nucleic i la quantitat de plantilla és molt petita, la qual cosa requereix que el sistema de reacció tingui una sensibilitat i una eficiència d'amplificació extremadament altes.