Base de disseny inicial (el 99% dels problemes es poden resoldre)
1. Durada del primer: el llibre de text requereix 15-30 pb, normalment uns 20 pb.La condició real és millor que sigui de 18-24 pb per garantir l'especificitat, però com més llarga millor, la imprimació massa llarga també reduirà l'especificitat i reduirà el rendiment.
2. Interval d'amplificació del primer: 200-500 pb és adequat i el fragment es pot ampliar a 10 kb en condicions específiques.
3. Base d'imprimació: el contingut de G + C ha de ser del 40-60%, l'efecte d'amplificació de G + C massa poc no és bo, massa G + C és fàcil d'aparèixer bandes no específiques.L'ATGC es distribueix millor de manera aleatòria, evitant agrupacions de més de 5 nucleòtids de purina o pirimidina.Multi-gc per a l'extrem 5' i seqüències intermèdies per augmentar l'estabilitat, eviteu GC ric a l'extrem 3', sense GC per a les 3 últimes bases o no GC per a 3 de les 5 últimes bases.
4. Eviteu l'estructura secundària en els primers, i eviteu la complementació entre dos primers, especialment la complementació a l'extrem de 3', en cas contrari es formarà un dímer d'imprimació i es generaran bandes amplificades no específiques.
5. Les bases a l'extrem 3' dels cebadors, especialment l'última i la penúltima bases, s'han d'aparellar estrictament per evitar el fracàs de la PCR a causa de bases terminals no aparellades.
6. Els cebadors tenen o es poden afegir amb llocs de clivatge adequats, i la seqüència diana amplificada hauria de tenir preferiblement llocs de clivatge adequats, cosa que és molt beneficiós per a l'anàlisi de clivatge o la clonació molecular.
7. Especificitat dels cebadors: els cebadors no haurien de tenir una homologia evident amb altres seqüències de la base de dades de seqüències d'àcids nucleics.
8. Aprèn a utilitzar el programari: PP5, Oligo6, DNAstar, Vector NTI, primer3 (Aquest disseny en línia funciona millor).
El contingut anterior pot resoldre almenys el 99% dels problemes de disseny d'imprimació.
Controlar els detalls del disseny de la imprimació
1. Longitud d'imprimació
La longitud general de la imprimació és de 18 ~ 30 bases.En general, el factor més important que determina la temperatura de recuit de la imprimació és la longitud de la imprimació.La temperatura de recuit de l'imprimació generalment es selecciona (valor Tm -5 ℃) i alguns utilitzen directament el valor Tm.Les fórmules següents es poden utilitzar per calcular aproximadament la temperatura de recuit dels primers.
Quan la longitud de l'imprimació és inferior a 20 pb: [4(G+C)+2(A+T)]-5℃
Quan la longitud de l'imprimació és superior a 20 pb: 62,3 ℃ + 0,41 ℃ (% GC) -500/longitud-5 ℃
A més, també es poden utilitzar molts programaris per calcular la temperatura de recuit, el principi de càlcul serà diferent, de manera que de vegades el valor calculat pot tenir un petit buit.Per optimitzar les reaccions de PCR, s'utilitzen els primers més curts que asseguren temperatures de recuit no inferiors a 54 ℃ per obtenir la millor eficiència i especificitat.
En general, l'especificitat del cebador augmenta en un factor de quatre per a cada nucleòtid addicional, de manera que la longitud mínima del cebador per a la majoria de les aplicacions és de 18 nucleòtids.El límit superior de la longitud de l'imprimació no és molt important, principalment relacionat amb l'eficiència de la reacció.A causa de l'entropia, com més llarg sigui el cebador, més baixa serà la velocitat a la qual s'acumula per unir-se a l'ADN objectiu per formar una plantilla estable de doble cadena perquè l'ADN polimerasa s'uneixi.
Quan s'utilitza programari per dissenyar encebadors, la longitud dels encebadors es pot determinar al seu torn pel valor TM, especialment per a encebadors de PCR quantitativa de fluorescència, s'ha de controlar TM = 60 ℃ més o menys.
2.GC contingut
En general, el contingut de G + C en seqüències d'imprimació és del 40% ~ 60%, i el contingut de GC i el valor de Tm d'un parell d'encebadors s'han de coordinar.Si l'imprimació té una tendència greu a GC o AT, es pot afegir una quantitat adequada de cua A, T o G i C a l'extrem de 5' de la imprimació.
3. Temperatura de recuit
La temperatura de recuit ha de ser 5 ℃ inferior a la temperatura de desencadenament.Si el nombre de bases d'imprimació és petit, la temperatura de recuit es pot augmentar adequadament, cosa que pot augmentar l'especificitat de la PCR.Si el nombre de bases és gran, la temperatura de recuit es pot reduir adequadament.La diferència de temperatura de recuit entre un parell d'imprimadors de 4 ℃ ~ 6 ℃ no afectarà el rendiment de la PCR, però idealment la temperatura de recuit d'un parell d'imprimacions és la mateixa, que pot variar entre 55 ℃ i 75 ℃.
4. Eviteu l'àrea d'estructura secundària de la plantilla d'amplificació
El millor és evitar la regió de l'estructura secundària de la plantilla en seleccionar el fragment amplificat.L'estructura secundària estable del fragment objectiu es pot predir i estimar mitjançant el programari informàtic rellevant, que és útil per a la selecció de plantilles.Els resultats experimentals mostren que l'expansió sovint no té èxit quan l'energia lliure (△G) de la regió a expandir és inferior a 58,6 lkJ/mol.
5. No coincideix amb l'ADN objectiu
Quan la seqüència d'ADN objectiu amplificada és gran, un cebador pot unir-se a diverses parts de l'ADN objectiu, donant lloc a que apareguin múltiples bandes al resultat.Aquesta vegada és necessari utilitzar la prova del programari BLAST, lloc web:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.Seleccioneu Alinear dues seqüències (bl2seq).
Enganxar seqüències d'imprimació a la zona 1 i seqüències d'ADN objectiu a la zona 2 és intercanviable, i BLAST calcula possibilitats complementàries, antisentit i altres, de manera que els usuaris no han de notar si ambdues cadenes són cadenes de sentit.També podeu introduir el número GI si coneixeu el número GI de la seqüència a la base de dades, de manera que no cal que enganxeu una secció gran de la seqüència.Finalment, feu clic a Alinea a 3 per veure si el cebador té diversos llocs homòlegs a l'ADN objectiu.
6. Primer terminal
L'extrem de 3' de la imprimació és on comença l'extensió, per la qual cosa és important evitar que els desajustaments comencin allà.L'extrem 3' no hauria de ser més de 3 G o C consecutius, perquè això farà que l'encebador s'activi per error a la regió de la seqüència d'enriquiment G+C.L'extrem 3' no pot formar cap estructura secundària, excepte en reaccions especials de PCR (AS-PCR), l'extrem 3' de l'encebador no es pot combinar.Per exemple, si la regió de codificació s'amplifica, l'extrem 3' de l'encebador no s'ha d'acabar a la tercera posició del codó, perquè la tercera posició del codó és propensa a degenerar, cosa que afectarà l'especificitat i l'eficiència de l'amplificació.Quan utilitzeu cebadors d'annexió, consulteu la taula d'ús de codons, presteu atenció a la preferència biològica, no utilitzeu cebadors d'annexió a l'extrem 3' i utilitzeu una concentració més alta de cebadors (1uM-3uM).
7. Estructura secundària dels primers
Els primers en si mateixos no haurien de tenir seqüències complementàries, en cas contrari, els propis cebadors es plegaran en estructures de forquilla, i aquesta estructura secundària afectarà la unió dels primers i les plantilles a causa de l'obstacle estèric.Si s'utilitza el judici artificial, les bases complementàries contínues dels propis primers no haurien de ser superiors a 3 pb.No hi hauria d'haver cap complementarietat entre els dos cebadors, especialment s'ha d'evitar la superposició complementària de l'extrem de 3' per evitar la formació de dímers d'imprimació.En general, no hi hauria d'haver més de 4 bases consecutives d'homologia o complementarietat entre un parell d'encebadors.
8. Afegiu marcadors o llocs
L'extrem 5' té poc efecte sobre l'especificitat de l'amplificació i, per tant, es pot modificar sense afectar l'especificitat de l'amplificació.La modificació de l'extrem de l'encebador 5 va incloure: afegir un lloc de restricció enzimàtica;Biotina marcada, fluorescència, digoxina, Eu3+, etc. Introduir seqüències d'ADN d'unió a proteïnes;Introducció de llocs de mutació, inserció i falta de seqüències de mutació i introducció de seqüències promotores, etc. Les bases addicionals afectaran més o menys l'eficiència de l'amplificació i augmentaran les possibilitats de formació de dímers d'encebador, però cal fer algunes concessions per al següent pas.Es poden afegir seqüències addicionals que no existeixen a la seqüència diana, com ara llocs de restricció i seqüències promotores, a l'extrem 5′ de l'encebador sense afectar l'especificitat.Aquestes seqüències no s'inclouen en el càlcul dels valors de Tm de l'encebador, però s'han de provar la complementarietat i l'estructura secundària interna.
9. Subclons
La majoria de les vegades, la PCR és només una clonació preliminar, i després hem de subclonar el fragment objectiu en diversos vectors, de manera que hem de dissenyar bases addicionals per a la següent operació del pas de PCR.
A continuació es resumeixen algunes seqüències dissenyades per a la subclonació.
Es va afegir el lloc de restricció de l'endonucleasa de restricció
L'addició de llocs de restricció enzimàtica és el mètode més utilitzat per subclonar productes de PCR.En general, el lloc d'escissió és de sis bases, a més de l'extrem de 5 'del lloc d'escissió, cal afegir 2 ~ 3 bases protectores.Tanmateix, el nombre de bases protectores necessàries per diferents enzims és diferent.Per exemple, SalⅠ no requereix cap base protectora, EcoRⅤ requereix 1 base protectora, NotⅠ requereix 2 bases protectores i Hind Ⅲ requereix 3 bases protectores.
LIC afegeix la cua
El nom complet de LIC és Ligation-Independent cloning, un mètode de clonació inventat per Navogen específicament per a la seva part del vector pET.El portador de pET preparat pel mètode LIC té extrems enganxosos d'una sola cadena de 12-15 bases no complementaris, que complementen els extrems enganxosos corresponents al fragment d'inserció objectiu.Amb finalitats d'amplificació, la seqüència d'imprimació 5' del fragment inserit hauria de complementar el vector LIC.L'activitat d'extracte 3'→5' de l'ADN polimerasa T4 pot formar un extrem enganxós de cadena única al fragment inserit al cap de poc temps.Com que el producte només es pot formar a partir del recuit mutu del fragment d'inserció preparat i del vector, aquest mètode és molt ràpid i eficaç, i és una clonació dirigida.
El clon de TA dirigit afegeix cua
La clonació de TA no va poder orientar el fragment a un vector, de manera que més tard Invitrogen va introduir un vector que podria orientar la clonació, que contenia quatre GTGGS de bases destacades en un extrem.Per tant, en el disseny d'encebadors de PCR, s'han d'afegir seqüències complementàries en conseqüència, de manera que els fragments es puguin "orientar".
Si teniu poc temps, podeu provar la síntesi directa, combinant el gen amb el vector, que és el que anomenem síntesi del gen ET en els musculistes.
D. Mètode de clonació In-Fusion
No es requereix lligasa, no requereix una reacció llarga.Sempre que s'introdueixi una seqüència als dos extrems del vector linealitzat En el disseny dels primers, el producte de PCR i el vector linealitzat s'afegeixen a la solució enzimàtica de fusió que conté BSA i es col·loquen a temperatura ambient durant mitja hora, es pot realitzar la transformació.Aquest mètode és especialment adequat per a la conversió de grans volums.
10. Combina la imprimació
De vegades, només es coneix informació limitada de la seqüència sobre el disseny d'imprimació.Per exemple, si només es coneix la seqüència d'aminoàcids, es pot dissenyar el cebador de fusió.Un cebador de fusió és una barreja de diferents seqüències que representen totes les diferents possibilitats de bases que codifiquen un sol aminoàcid.Per augmentar l'especificitat, podeu consultar la taula d'ús de codons per reduir l'annexió segons les preferències d'ús base dels diferents organismes.La hipoxantina es pot combinar amb totes les bases per reduir la temperatura de recuit de la imprimació.No utilitzeu les bases annexades a l'extrem 3' de la imprimació perquè el recuit de les 3 últimes bases a l'extrem 3' és suficient per iniciar la PCR al lloc equivocat.S'utilitzen concentracions d'imprimació més altes (1 μM a 3 μM) perquè els cebadors de moltes mescles d'annexió no són específics de la plantilla objectiu.
Matèries primeres PCRcontrol
1. Quantitat d'imprimació
La concentració de cada imprimació és de 0,1 ~ 1 umol o 10 ~ 100 pmol.És millor produir el resultat requerit amb la quantitat més baixa d'imprimació.L'alta concentració d'imprimació provocarà un desajustament i una amplificació inespecífica, i augmentarà la possibilitat de formar dímers entre els primers.
2. Concentració del primer
La concentració de primers afecta l'especificitat.La concentració d'imprimació òptima és generalment entre 0,1 i 0,5 μM.Les concentracions més altes d'imprimació condueixen a l'amplificació de productes inespecífics.
3. Temperatura de recuit de la imprimació
Un altre paràmetre important per als imprimadors és la temperatura de fusió (Tm).Aquesta és la temperatura en què el 50% dels cebadors i seqüències complementàries es representen com a molècules d'ADN de doble cadena.Es requereix Tm per establir la temperatura de recuit de PCR.Idealment, la temperatura de recuit és prou baixa per garantir un recuit efectiu dels primers amb la seqüència objectiu, però prou alta com per reduir la unió inespecífica.Temperatura de recuit raonable de 55 ℃ a 70 ℃.La temperatura de recuit generalment s'estableix 5 ℃ per sota de la Tm de la imprimació.
Hi ha diverses fórmules per fixar Tm, que varien molt segons la fórmula utilitzada i la seqüència dels cebadors.Com que la majoria de fórmules proporcionen un valor estimat de Tm, totes les temperatures de recuit són només un punt de partida.L'especificitat es pot millorar analitzant diverses reaccions que augmenten progressivament la temperatura de recuit.Comenceu per sota de la Tm-5℃ estimada i augmenteu gradualment la temperatura de recuit en un increment de 2℃.Una temperatura de recuit més alta reduirà la formació de dímers d'imprimació i productes inespecífics.Per obtenir els millors resultats, els dos primers haurien de tenir valors aproximats de Tm.Si la diferència de Tm dels parells d'imprimació és superior a 5 ℃, els primers mostraran un inici fals significatiu utilitzant una temperatura de recuit més baixa al cicle.Si els dos primers Tm són diferents, establiu la temperatura de recuit a 5 ℃ inferior a la Tm més baixa.Alternativament, per augmentar l'especificitat, primer es poden realitzar cinc cicles a temperatures de recuit dissenyades per a una Tm més alta, seguits dels cicles restants a temperatures de recuit dissenyades per a una Tm més baixa.Això permet obtenir una còpia parcial de la plantilla de destinació en condicions reduïdes.
4. Puresa i estabilitat de la imprimació
La puresa estàndard dels primers personalitzats és adequada per a la majoria d'aplicacions de PCR.L'eliminació dels grups benzoil i isobutilil mitjançant la dessalació és mínima i, per tant, no interfereix amb la PCR.Algunes aplicacions requereixen purificació per eliminar qualsevol seqüència que no sigui de longitud completa en el procés de síntesi.Aquestes seqüències truncades es produeixen perquè l'eficiència de la química de síntesi d'ADN no és del 100%.Aquest és un procés circular que utilitza reaccions químiques repetides a mesura que s'afegeix cada base per fer ADN de 3′ a 5′.Podeu fallar en qualsevol dels dos cicles.Els cebadors més llargs, especialment els de més de 50 bases, tenen una gran proporció de seqüències truncades i poden requerir purificació.
El rendiment dels primers es veu afectat per l'eficiència de la química sintètica i el mètode de purificació.Les empreses biofarmacèutiques, com Cytology i Shengong, utilitzen totes una unitat de DO mínima per garantir la producció total d'oligonucleòsids.Les imprimacions personalitzades s'envien en forma de pols seca.El millor és tornar a dissoldre els primers en TE de manera que la concentració final sigui de 100 μM.TE és millor que l'aigua desionitzada perquè el pH de l'aigua sovint és àcid i provocarà la hidròlisi dels oligonucleòsids.
L'estabilitat de les imprimacions depèn de les condicions d'emmagatzematge.La pols seca i les imprimacions dissoltes s'han d'emmagatzemar a -20 ℃.Els primers dissolts en TE a concentracions superiors a 10 μM es poden emmagatzemar de manera estable a -20 ℃ durant 6 mesos, però només es poden emmagatzemar a temperatura ambient (15 ℃ a 30 ℃) durant menys d'1 setmana.Les imprimacions en pols seques es poden emmagatzemar a -20 C durant almenys 1 any i a temperatura ambient (15 C a 30 C) fins a 2 mesos.
5. Enzims i les seves concentracions
Actualment, l'ADN polimerasa Taq utilitzada és bàsicament l'enzim d'enginyeria gènica sintetitzat pels bacteris coliformes.La quantitat d'enzim necessària per catalitzar una reacció de PCR típica és d'uns 2,5 U (es refereix al volum de reacció total de 100 ul).Si la concentració és massa alta, pot provocar una amplificació inespecífica;si la concentració és massa baixa, es reduirà la quantitat de producte sintètic.
6. Qualitat i concentració de dNTP
La qualitat del dNTP està estretament relacionada amb la concentració i l'eficiència de l'amplificació per PCR.El dNTP en pols és granular i la seva variabilitat perd la seva activitat biològica si s'emmagatzema de manera inadequada.La solució dNTP és àcida i s'ha d'utilitzar en alta concentració, amb una solució tampó 1M de NaOH o 1M de Tris.HCL per ajustar el seu PH a 7,0 ~ 7,5, petita quantitat de subenvasos, emmagatzematge congelat a -20 ℃.La congelació-descongelació múltiple degradarà dNTP.En la reacció de PCR, el dNTP hauria de ser de 50 ~ 200 umol/L.Especialment, s'ha de prestar atenció a la concentració dels quatre DNTPS ha de ser igual (preparació de mols iguals).Si la concentració d'algun d'ells és diferent de les altres (més alta o menor), es produirà un desajust.Una concentració massa baixa reduirà el rendiment dels productes de PCR.dNTP es pot combinar amb Mg2+ i reduir la concentració de Mg2+ lliure.
7. Plantilla (gen diana) àcid nucleic
La quantitat i el grau de purificació de l'àcid nucleic plantilla és un dels enllaços clau per a l'èxit o el fracàs de la PCR.Els mètodes tradicionals de purificació d'ADN solen utilitzar SDS i proteasa K per digerir i eliminar mostres.Les principals funcions de l'SDS són: dissoldre lípids i proteïnes a la membrana cel·lular, destruint així la membrana cel·lular dissolent proteïnes de membrana, i dissociar proteïnes nuclears a la cèl·lula, SDS també es pot combinar amb proteïnes i precipitar;La proteasa K pot hidrolitzar i digerir proteïnes, especialment histones lligades a l'ADN, i després utilitzar fenol i cloroform amb dissolvent orgànic per extreure proteïnes i altres components cel·lulars, i utilitzar etanol o alcohol isopropílic per precipitar l'àcid nucleic.L'àcid nucleic extret es pot utilitzar com a plantilla per a reaccions de PCR.Per a mostres de detecció clínica general, es pot utilitzar un mètode ràpid i senzill per dissoldre cèl·lules, lisar patògens, digerir i eliminar proteïnes dels cromosomes per alliberar gens diana i utilitzar-lo directament per a l'amplificació per PCR.L'extracció de plantilla d'ARN normalment utilitza el mètode d'isotiocianat de guanidina o proteasa K per evitar que la RNasa degradi l'ARN.
8.Concentració de Mg2+
Mg2 + té un efecte significatiu sobre l'especificitat i el rendiment de l'amplificació per PCR.En general, la reacció de PCR, quan la concentració de diversos dNTP és de 200 umol/L, la concentració adequada de Mg2+ és d'1,5 ~ 2,0 mmol/L.La concentració de Mg2+ és massa alta, l'especificitat de la reacció disminueix, es produeix una amplificació inespecífica, una concentració massa baixa reduirà l'activitat de l'ADN polimerasa Taq, donant lloc a la reducció dels productes de reacció.
Els ions de magnesi afecten diversos aspectes de la PCR, com l'activitat de l'ADN polimerasa, que afecta el rendiment;Un altre exemple és el recuit d'imprimació, que afecta l'especificitat.El dNTP i la plantilla s'uneixen a l'ió magnesi, reduint la quantitat d'ió magnesi lliure necessària per a l'activitat enzimàtica.La concentració òptima d'ions de magnesi varia per a diferents parells i plantilles d'imprimació, però una concentració inicial de PCR típica amb 200 μM dNTP és d'1,5 mM (nota: per a la PCR quantitativa en temps real, utilitzeu una solució d'ions de magnesi de 3 a 5 mM amb una sonda fluorescent).Les concentracions més altes d'ions de magnesi lliures augmenten el rendiment, però també augmenten l'amplificació inespecífica i disminueixen la fidelitat.Per determinar la concentració òptima, es van realitzar valoracions d'ions de magnesi en increments de 0,5 mM d'1 mM a 3 mM.Per reduir la dependència de l'optimització d'ions magnesi, es pot utilitzar la DNA polimerasa Platinum Taq.La Taq DNA polimerasa de platí és capaç de mantenir la funció en un rang més ampli de concentracions d'ions magnesi que la Taq DNA polimerasa i, per tant, requereix menys optimització.
9. Additius promotors de PCR
L'optimització de la temperatura de recuit, el disseny d'imprimació i la concentració d'ions magnesi és suficient per a una amplificació molt específica de la majoria de plantilles;no obstant això, algunes plantilles, incloses les que tenen un alt contingut de GC, requereixen mesures addicionals.Els additius que afecten la temperatura de fusió de l'ADN ofereixen una altra manera de millorar l'especificitat i el rendiment del producte.Es requereix una desnaturalització completa de la plantilla per obtenir els millors resultats.
A més, l'estructura secundària impedeix la unió del primer i l'extensió de l'enzim.
Els additius de PCR, que inclouen formamida, DMSO, glicerina, betaïna i PCRx Enhancer Solution, milloren l'amplificació.El seu possible mecanisme és reduir la temperatura de fusió, ajudant així al recuit dels primers i ajudant a l'extensió de l'ADN polimerasa a través de la regió de l'estructura secundària.La solució PCRx té altres avantatges.Es requereix una optimització mínima dels ions de magnesi quan s'utilitza amb l'ADN polimerasa Platinum Taq i l'ADN polimerasa Platí Pfx.Així, la tècnica del platí es combina amb l'additiu per augmentar l'especificitat alhora que es redueix la dependència del tercer enfocament, l'optimització d'ions magnesi.Per obtenir els millors resultats, s'ha d'optimitzar la concentració d'additius, especialment DMSO, formamida i glicerol, que inhibeixen l'ADN polimerasa Taq.
10. Arrancada en calent
La PCR d'inici en calent és un dels mètodes més importants per millorar l'especificitat de la PCR a més d'un bon disseny d'imprimació.Tot i que la temperatura òptima d'allargament de l'ADN polimerasa Taq és de 72 ℃, la polimerasa roman activa a temperatura ambient.Així, es produeixen productes inespecífics quan la temperatura de manteniment és inferior a la temperatura de recuit durant la preparació de la reacció de PCR i a l'inici del cicle tèrmic.Un cop formats, aquests productes inespecífics s'amplifiquen efectivament.La PCR d'inici en calent és especialment eficaç quan els llocs utilitzats per al disseny d'imprimació estan limitats per la ubicació d'elements genètics, com ara mutacions dirigides al lloc, clonació d'expressió o construcció i manipulació d'elements genètics utilitzats per a l'enginyeria de l'ADN.
Un mètode comú per limitar l'activitat de l'ADN polimerasa Taq és preparar la solució de reacció de PCR sobre gel i col·locar-la en un aparell de PCR preescalfat.Aquest mètode és senzill i econòmic, però no completa l'activitat de l'enzim i, per tant, no elimina completament l'amplificació de productes inespecífics.
L'amortiment tèrmic retarda la síntesi d'ADN inhibint un component essencial fins que l'aparell de PCR arriba a la temperatura de desnaturalització.La majoria dels mètodes manuals d'iniciació tèrmica, inclosa l'addició retardada de l'ADN polimerasa Taq, són complicats, especialment per a aplicacions d'alt rendiment.Altres mètodes d'imprimació tèrmica utilitzen un escut de cera per tancar un component essencial, inclosos ions de magnesi o enzims, o per aïllar físicament components reactius, com ara plantilles i tampons.Durant el cicle tèrmic, els diferents components s'alliberen i es barregen a mesura que la cera es fon.Igual que el mètode d'arrencada en calent manual, el mètode d'escut de cera és feixuc i propens a la contaminació i no és adequat per a aplicacions d'alt rendiment.
L'ADN polimerasa de platí és convenient i eficient per a la PCR d'arrencada en calent automàtica.Platinum Taq DNA polimerasa consisteix en Taq DNA polimerasa recombinant combinada amb anticossos monoclonals contra Taq DNA polimerasa.Els anticossos es formulen per PCR per inhibir l'activitat enzimàtica durant la temperatura prolongada.La Taq DNA polimerasa es va alliberar a la reacció durant l'aïllament de 94 ℃ de l'etapa de desnaturalització, restaurant l'activitat completa de la polimerasa.A diferència de l'ADN polimerasa Taq modificada químicament per a la iniciació tèrmica, l'enzim platí no requereix un aïllament prolongat a 94 ℃ (de 10 a 15 minuts) per activar la polimerasa.Amb l'ADN polimerasa PlatinumTaq, el 90% de l'activitat de l'ADN polimerasa Taq es va restaurar després de 2 minuts a 94 ℃.
11. Nest-PCR
Les successives rondes d'amplificació utilitzant primers imbricats poden millorar l'especificitat i la sensibilitat.La primera ronda és una amplificació estàndard de 15 a 20 cicles.Una petita fracció del producte d'amplificació inicial es va diluir de 100 a 1000 vegades i es va afegir a la segona ronda d'amplificació durant 15 a 20 cicles.Alternativament, el producte amplificat inicial es pot dimensionar mitjançant purificació en gel.A la segona ronda d'amplificació s'utilitza un cebador imbricat, que es pot unir a la seqüència diana dins del primer cebador.L'ús de PCR imbricada redueix la possibilitat d'amplificació de múltiples llocs diana perquè hi ha poques seqüències diana complementàries als dos conjunts d'encebadors.El mateix nombre total de cicles (30 a 40) amb els mateixos primers va amplificar els llocs inespecífics.La PCR niuada augmenta la sensibilitat de seqüències diana limitades (per exemple, mrnas rares) i millora l'especificitat de PCRS difícils (per exemple, 5′ RACE).
12. PCR descendent
La PCR descendent millora l'especificitat mitjançant l'ús de condicions de recuit ajustades durant els primers cicles de PCR.El cicle comença a una temperatura de recuit aproximadament 5 ℃ superior a la Tm estimada, després cada cicle es redueix d'1 ℃ a 2 ℃ fins que la temperatura de recuit és inferior a 5 ℃.Només s'amplificarà la plantilla de destinació amb la major homologia.Aquests productes continuen expandint-se en cicles posteriors, eliminant els productes inespecífics amplificats.La PCR descendent és útil per a mètodes on no es coneix el grau d'homologia entre l'imprimació i la plantilla objectiu, com ara l'empremta digital d'ADN AFLP.
Kits de PCR relacionats
L'heroi 2× PCRTMEl sistema Mix té una tolerància més alta als inhibidors de PCR que el sistema PCR Mix ordinari i pot fer front fàcilment a l'amplificació de PCR de diverses plantilles complexes.El sistema de reacció únic i el Taq Hero d'alta eficiència fan que la reacció de PCR tingui una eficiència, especificitat i sensibilitat d'amplificació més alta.
Major eficiència d'amplificació
Té activitat DNA polimerasa 5'→3' i activitat exonucleasa 5'→3', sense activitat exonucleasa 3'→5'.
Kit PCR en temps real Easyᵀᴹ-SYBR Green I
Específic: el tampó optimitzat i l'enzim Taq d'arrencada en calent poden prevenir l'amplificació inespecífica i la formació de dímers d'imprimació
Alta sensibilitat: pot detectar còpies baixes de la plantilla
El kit utilitza un reactiu de transcripció inversa Foregene únic i Foregene HotStar Taq DNA Polymerase combinat amb un sistema de reacció únic per millorar eficaçment l'eficiència i l'especificitat de l'amplificació de la reacció.
Hora de publicació: maig-09-2023
