Crec que tothom es trobarà sempre amb tal o tal problema en fer reaccions de PCR, però la majoria d'ells es poden classificar en dos problemes principals:

Massa poca amplificació de la plantilla del gen (amplificació);
Massa amplificació de gens no objectiu.
L'ús d'additius és una de les estratègies habituals per resoldre aquests problemes.Normalment, el paper dels additius té dos aspectes:
estructura secundàriadels gens (estructura secundària);
Reduir l'imprimació inespecífica.
Avui, l'editor us presentarà breument els additius comuns en les reaccions de PCR i les seves funcions.
Additius que redueixen l'estructura secundària
sulfòxid(DMSO)
mostres de gensamb alt contingut de GC.Tanmateix, el DMSO també redueix molt l'activitat de la polimerasa Taq.Per tant, tothom ha d'equilibrar l'accessibilitat de la plantilla i l'activitat de la polimerasa.L'editor suggereix que podeu provar diferents concentracions de DSMO, com ara del 2% al 10%, per trobar la concentració que s'adapti al vostre experiment.
Detergents no iònics
Els detergents no iònics, com ara 0,1-1% Triton X-100, Tween 20 o NP-40, solen reduir l'estructura secundària de l'ADN.Tot i que això pot augmentar l'amplificació del gen plantilla, també causarà problemes d'amplificació inespecífica.Per tant, aquests additius funcionen bé per a reaccions de PCR de baix rendiment sense residus, però no tan bé per a reaccions de PRC relativament impures.Un altre avantatge dels detergents no iònics és la reducció de la contaminació de SDS.En general, durant el procés d'extracció d'ADN, l'SDS es portarà a l'etapa de PCR, que inhibeix molt l'activitat de la polimerasa.Per tant, afegir un 0,5% de Tween-20 o Tween-40 a la reacció pot neutralitzar els efectes negatius de l'SDS.
Betaïna_
La betaïna pot millorar l'amplificació de l'ADN reduint la formació d'estructura secundària i, en general, és una addició "misteriosa" als kits de PCR comercials.Si voleu utilitzar betaïna, heu de posar betaïna o betaïna monohidrat (betaïna o betaïna monohidrat), però no clorhidrat de betaïna (betaïna HCl), ajustar a una concentració final d'1-1,7 M.La betaïna també pot ajudar a millorar l'especificitat perquè elimina la dependència de la composició del parell de bases de la fusió/desnaturalització de l'ADN.
Additius per reduir la imprimació inespecífica
Formamida
La formamida és un additiu orgànic de PCR utilitzat habitualment.Es pot combinar amb el solc principal i el solc menor de l'ADN, reduint així l'estabilitat de la doble hèlix de l'ADN mestre i reduint la temperatura de fusió de l'ADN.La concentració de formamida utilitzada en experiments de PCR sol ser de l'1%-5%.
Tetrametilclorur d'amoni( TMAC)
El clorur de tetrametilamoni pot augmentar l'especificitat de la hibridació (especificitat d'hibridació) i augmentar la temperatura de fusió de l'ADN.Així, el TMAC pot eliminar l'amortiment no específic i reduir la unió incorrecta de l'ADN i l'ARN.Si utilitzeuprimers degeneratsa la reacció de PCR, recordeu afegir TMAC, que s'utilitza habitualment a una concentració de 15-100 mM.
Altres additius comuns
A més de les dues categories d'additius esmentades anteriorment, hi ha molts additius comuns en les reaccions de PCR, encara que tenen funcions diferents, també són molt importants.
Ió magnesi
L'ió magnesi és un cofactor (cofactor) indispensable de la polimerasa, és a dir, sense ió magnesi, la polimerasa està inactiva.Tanmateix, un excés d'ions de magnesi també pot afectar l'eficiència de la polimerasa.La concentració d'ions magnesi en cada reacció de PCR variarà.Els agents quelants (com l'EDTA o el citrat), la concentració de dNTPs i les proteïnes afecten la concentració d'ions magnesi.Per tant, si teniu problemes amb el vostre experiment de PCR, podeu provar de canviar diferents concentracions d'ions magnesi, per exemple, d'1,0 a 4,0 mM, amb un interval de 0,5 a 1 mM entremig.
Val la pena assenyalar que diversos cicles de congelació-descongelació poden conduir a l'estratificació de la concentració de la solució de clorur de magnesi.Per tant, l'has de dissoldre completament abans de cada ús, i barrejar-lo bé abans d'utilitzar-lo.
Albúmina sèrica bovina(Albúmina bovina, BSA)
En experiments de química molecular, l'albúmina sèrica bovina és un additiu molt comú, especialment en experiments de digestió amb enzims de restricció i PCR.En les reaccions de PCR, la BSA és útil per reduir contaminants com els compostos fenòlics.I també es diu que pot reduir l'adhesió dels reactius a la paret del tub d'assaig.En la reacció de PCR, normalment la concentració de BSA afegit pot arribar a 0,8 mg/ml.
 
Productes relacionats:
PCR Hero(amb colorant)
PCR Hero