Autors: Wang Xiaoyan, Zhao Eryu

Unitat: Hospital Jiaozhou, Hospital Dongfang Afiliat a la Universitat de Tongji

Actualment, el tipus de mostra principal per a la detecció d'àcids nucleics de patògens respiratoris és el hisop de gola.Hi ha molts tipus de solucions de conservació de mostres d'ús habitual, totes elles s'han de refrigerar o congelar per al seu transport i emmagatzematge;És difícil controlar tot el procés de baixa temperatura durant el procés de recollida i transport, i és difícil assegurar el control de qualitat abans de la prova de la mostra^[1-2].

La RNasa (RNasa) és una endonucleasa que hidrolitza l'ARN, principalment tallant els enllaços fosfodièster entre nucleòtids.La molècula de RNasa és molt estable, hi ha enllaços disulfur a l'estructura i la seva activitat no requereix la presència de cations divalents, de manera que la RNasa no es desnaturalitza fàcilment i és fàcil de renaturalitzar fins i tot després d'alta temperatura o l'ús de desnaturalitzants.Les RNases es divideixen en endògenes i exògenes.Les RNases endògenes es poden alliberar al mateix temps quan es trenquen les cèl·lules.Per tant, eliminar el paper de les RNases endògenes és un pas molt crític en el procés d'extracció de l'ARN.Les RNases exògenes estan àmpliament distribuïdes.Les RNases existeixen a l'aire, la pell humana, el cabell i la saliva, que són raons importants per a la fàcil degradació de l'ARN.^[3].

Consulta de dades

CANS-CL02-A009 "Aplicació de les directrius d'acreditació de qualitat i competències del laboratori mèdic en l'àmbit del diagnòstic molecular" als requisits tècnics proposa que s'haurien de formular estàndards de qualitat de l'aigua adequats segons l'aplicació;Envasos hermètics d'un sol ús:

RNasa/classificació

(1) RNasa A

La ribonucleasa A (RNasa A), derivada del pàncrees boví, és una endoribonucleasa que pot atacar específicament l'extrem 3' dels residus de pirimidina de l'ARN, tallant la citosina o l'uracil format per nucleòtids adjacents.Enllaç fosfodièster, el producte final de la reacció és un nucleòtid de pirimidina de 3′ i un oligonucleòtid amb un nucleòtid de pirimidina de 3′ al final.

(2) RNasa T1

La ribonucleasa T1 (RNasa T1) deriva d'Aspergillus orjzae, actua específicament sobre el fosfat 3′-terminal de la guanina i el lloc de clivatge es troba entre el fosfat 3′ de la guanina i l'hidroxil 5′ dels nucleòtids adjacents.El producte final de la reacció és àcid 3′guanílic i fragments d'oligonucleòtids amb àcid 3′guanílic al final.

(3) RNasa H

La ribonucleasa H (RNasa H) es va descobrir per primera vegada a partir del teixit del tim de vedella i el seu gen codificant s'ha clonat a Escherichia coli.Pot degradar específicament l'ADN: cadenes d'ARN en dúplex híbrids d'ARN, donant lloc a oligonucleòtids i mononucleòtids amb extrems 3′-OH i 5′-monofosfat, no pot degradar l'ADN o l'ARN de cadena simple o doble.

RNasa

Funció i ús

La ribonucleasa pot catalitzar la degradació de l'àcid ribonucleic (ARN) i es pot sintetitzar artificialment.La pomada medicinal s'utilitza tòpicament per tractar traumes i dolors articulars.Segons els informes, la ribonucleasa pot canviar el metabolisme de la cèl·lula hoste, inhibir la síntesi del virus, inhibir la proliferació del virus de la grip in vitro i inhibir la formació del virus de la vacuna i l'herpes en embrions de pollastre.Ús clínic de la ribonucleasa injecció intramuscular diària de 180 mg, beneficiosa per al tractament de l'encefalitis epidèmica, la ribonucleasa pot catalitzar la degradació de l'àcid ribonucleic (ARN) i ara es pot sintetitzar artificialment.La pomada medicinal s'utilitza tòpicament per tractar traumes i dolors articulars.Segons els informes, la ribonucleasa pot canviar el metabolisme de la cèl·lula hoste, inhibir la síntesi del virus, inhibir la proliferació del virus de la grip in vitro i inhibir la formació del virus de la vacuna i l'herpes en embrions de pollastre.L'ús clínic de la injecció intramuscular diària de 180 mg de ribonucleasa és beneficiós per al tractament de l'encefalitis epidèmica.

RNasa

Definició d'inhibidor

Definició d'unitat inhibidora de la RNasa: la quantitat d'enzim necessària per inhibir el 50% de l'activitat de la 5ng RNasa A és una unitat.

Com funcionen els inhibidors de la RNasa

Isotiocianat de guanidina:

L'isotiocianat de guanidina és un compost orgànic amb la fórmula molecular C2H6N4S.S'utilitza principalment en medicina biològica, reactius químics, etc. L'isotiocianat de guanidina és un agent de lisi de proteïnes i sovint s'utilitza com a component principal de la solució de lisi en reactius de diagnòstic molecular.Pot lisar el teixit, destruir l'estructura cel·lular i dissociar l'àcid nucleic de la nucleoproteïna, i té una forta desnaturalització a la RNasa.És l'inhibidor de la RNasa més eficaç actualment.

TRIzol és un nou reactiu d'extracció d'ARN total que pot extreure directament l'ARN total de cèl·lules o teixits.Conté substàncies com el fenol i l'isotiocianat de guanidina, que poden alterar ràpidament les cèl·lules i inhibir les nucleases alliberades per les cèl·lules.

(No obstant això, l'isotiocianat de guanidina és perillós per a la salut dels investigadors de laboratori).

RNAsina:

Glicoproteïna àcida extreta del fetge de rata o del blastoderm humà.La rnasina és un inhibidor no competitiu de la RNasa, que pot unir-se a diverses RNases per inactivar-les.

(Més detalls: https://www.foreivd.com/foreasy-rnase-inhibitor-product/)

Htemperatura alta:

La temperatura alta també és un mitjà comú de desnaturalització de proteïnes.

Pirocarbonat de dietil (DEPC):

DEPC és un inhibidor de la RNasa fort però incomplet, que pot inhibir l'activitat de la RNasa combinant-se amb l'anell imidazol d'aminoàcids del grup actiu de la RNasa per desnaturalitzar les proteïnes.

Complex de ribonucleòsids de vanadil:

Un complex format per ions i nucleòsids d'òxid de vanadi, que s'uneix a la RNasa en forma de substàncies de transició, que poden inhibir gairebé completament l'activitat de la RNasa.

altres:

SDS, urea, terra de diatomeas, etc. també tenen un cert efecte inhibidor sobre la RNasa.

Revisions d'experts

Li Yujie Tècnic en cap

Director del Departament de Laboratori, Hospital Jiaozhou, Hospital Dongfang Afiliat a la Universitat de Tongji

Per tal d'evitar la biodegradació de la RNasa exògena, s'han d'utilitzar màscares, guants i barrets i substituir-los amb freqüència durant el procés d'extracció de l'ARN.Tots els objectes de vidre s'han de coure en un forn d'assecat a 200 °C durant més de 2 hores.Els materials utilitzats per a la cocció, com el plàstic, s'han de tractar amb aigua DEPC i després rentar-los amb aigua destil·lada.Els reactius o dispositius utilitzats per a l'extracció, conservació i identificació de l'ARN s'han de dedicar a l'ARN, i s'ha d'establir una àrea d'operació d'ARN independent.

referències:

[1] Smith-Vaughan HC, Binks MJ, Beissbarth J, et al.Bacteris i virus a la nasofaringe immediatament abans de l'aparició d'infeccions respiratòries inferiors agudes en nens indígenes australians [J].Eur J Clin Microbiol Infect Dis,2018,37 (9): 1785-1794.

[2] Subdivisió de control d'infeccions hospitalàries de l'Associació de Medicina Preventiva Xinesa.Directrius per a la recollida i inspecció de mostres microbianes clíniques [J].Revista xinesa d'infeccions hospitalàries, 2018 (20): 3192-3200.

[3] "Prova clínica deu mil per què volum de proves de biologia molecular"