Les transcriptases inverses tradicionals no poden tolerar altes temperatures (la temperatura òptima per a l'activitat de MMLV és de 37-50 °C, i l'AMV és de 42-60 °C).L'ARN viral més complex no es pot transcriure de manera eficaç a l'ADNc a baixes temperatures, donant lloc a una eficiència de detecció La reducció.La RT-qPCR tradicional requereix generalment la participació de dos enzims clau (transcriptasa inversa i ADN polimerasa), cosa que fa impossible simplificar el funcionament del sistema de reacció i reduir el cost.Aquí introduirem dues transcriptases inverses resistents a altes temperatures, TtH i RevTaq.Aquests dos enzims també tenen la funció de l'ADN polimerasa, per això s'anomenen enzims bifuncionals.

ADN polimerasa TtH

Deu haver sentit parlar de TtH, que es deriva del bacteri termòfil Thermus thermophilus HB8.En presència de cations divalents com Mg2+, té activitat DNA polimerasa.S'utilitza àmpliament en reaccions de PCR com l'enzim Taq, però té una major resistència a la calor que l'enzim Taq, de manera que també té un millor efecte en la PCR amb plantilles d'alt contingut de GC.

· Aquest enzim bàsicament no té activitat exonucleasa 3′→5′ i activitat exonucleasa 5′→3′, per la qual cosa també es pot utilitzar per a la seqüenciació de didesoxi.

· Aquest enzim té activitat RTasa.En presència de Mn2+, es millorarà l'activitat de la RTasa.Utilitzant aquesta característica, es pot utilitzar per realitzar una reacció de transcripció inversa i una reacció de PCR al mateix tub, és a dir, RT-PCR d'un sol pas.Tanmateix, en presència de Mn2+, la precisió de la RT-PCR no és alta.L'activitat RT no té res a veure amb l'activitat rnaasa H.

· L'augment de l'activitat de la Tth-ADN polimerasa (pH9, òptim +55℃~+70℃, màxim +95℃) supera els problemes causats per l'estructura secundària de l'ARN.L'ADNc resultant es pot amplificar per PCR amb el mateix enzim en presència d'ions Mg2+.

· La capacitat de la Tth-ADN polimerasa per realitzar la transcripció inversa i l'amplificació de l'ADN a altes temperatures fa que aquest enzim sigui útil per a RT-PCR quantitativa, clonació i anàlisi d'expressió gènica d'ARN cel·lular i viral.
· La Tth-DNA polimerasa s'utilitza per a la RT-PCR per amplificar l'ARN fins a 1 kb.

Característiques i avantatges

Tth DNA polimerasa:

• Assegureu-vos que la mida del producte de reacció en cadena de la polimerasa (PCR) optimitzada, almenys 1000 pb en la reacció RT-PCR

• Acceptar com a substrat el desoxiribonucleòsid trifosfat modificat

• No relacionat amb l'activitat de la RNasa H

• Té una alta estabilitat tèrmica per superar problemes, generalment relacionats amb l'alta estructura secundària present en l'ARN

RevTaq RT-PCR DNA polimerasa

ADN polimerasa resistent a la calor amb activitat de transcriptasa inversa

La RevTaq-RT-PCR-DNA polimerasa és un enzim de doble funció dissenyat, altament resistent a la calor amb activitats de transcriptasa inversa i DNA polimerasa obtingudes mitjançant evolució dirigida i artificial.

· La semivida de la DNA polimerasa RevTaq RT-PCR a 95 °C és superior a 40 minuts.

· RevTaq RT-PCR DNA polimerasa permet la transcripció inversa a alta temperatura directament des de la plantilla d'ARN, i el pas de transcripció inversa es pot repetir diverses vegades per generar més plantilles d'ADNc.

· RevTaq RT-PCR DNA polimerasa permet una RT-PCR “pas zero” (sense pas de transcripció inversa isotèrmica), perquè en el pas d'extensió de la PCR cíclica, la transcripció inversa i l'amplificació de l'ADN es produeixen simultàniament.Això també afavoreix la reacció de transcripció inversa a altes temperatures, minimitzant així els problemes que es troben en la fusió de la forta estructura secundària de l'ARN a altes temperatures.

· A causa de la fórmula d'arrencada en calent basada en aptàmer, RevTaq RT-PCR DNA polimerasa produirà millors resultats quan la temperatura de recuit i extensió sigui superior a 57 °C.

· Atès que l'enzim és resistent a la calor, es recomana dissenyar primers i sondes amb punts de fusió molt elevats (>60°C).

· Es recomana optimitzar la temperatura del pas de recuit/extensió mitjançant un gradient de temperatura durant el procés de configuració de la reacció.

· Com més alta sigui la temperatura, més alta serà l'especificitat de la PCR.El cicle de transcripció inversa es realitza normalment a una temperatura més alta que el cicle de PCR, perquè la hibridació DNA Primer:RNA Template sol tenir un punt de fusió més alt que DNA Primer:cDNA Template dúplex.

· La DNA polimerasa RevTaq RT-PCR està dissenyada i optimitzada genèticament, i la mida de l'amplicó és d'entre 60 i 300 pb.

El límit de detecció de la DNA polimerasa de RevTaq RT-PCR arriba a les 4 còpies/

A la figura es mostra el sistema de reacció optimitzat (l'establiment d'imprimadors d'alt punt de fusió).La RT-PCR impulsada per la polimerasa d'ADN RevTaq RT-PCR mostra una millor sensibilitat que la barreja mestra RT-qPCR d'1 pas TaqPath i un gradient de dilució de la mostra de detecció més baix.

Més avantatges:

Funció d'inici ràpid → El pas inicial de desnaturalització tèrmica es pot saltar.

Fórmula d'aptàmer d'arrencada en calent → Proporciona una activitat enzimàtica del 100% immediatament i evita l'amplificació inespecífica a baixes temperatures (<57 °C).

Funció d'escissió → S'omet l'etapa d'extracció de l'ARN, perquè la polimerasa d'ADN RevTaq RT-PCR també pot processar mostres de reacció brutes.Pot destruir immediatament les membranes cel·lulars d'eucariotes, bacteris i virus en un cicle calent de RT-PCR.

Nivell de matèria primera IVD → alts estàndards de qualitat i preus extremadament competitius