La PCR és la tecnologia d'amplificació d'àcids nucleics més utilitzada i s'utilitza àmpliament per la seva sensibilitat i especificitat.Tanmateix, la PCR requereix una desnaturalització tèrmica repetida i no pot desfer-se de les limitacions de dependre d'instruments i equips, la qual cosa limita la seva aplicació en proves de camp clínic.

Des de principis de la dècada de 1990, molts laboratoris han començat a desenvolupar tecnologia d'amplificació a temperatura constant que no requereix desnaturalització tèrmica.Ara han desenvolupat la tecnologia d'amplificació isotèrmica mediada per bucle, la tecnologia d'amplificació isotèrmica de substitució de cadena, la tecnologia d'amplificació isotèrmica de cercle rodant i la dependència de la seqüència d'àcids nucleics.Tecnologia d'amplificació isotèrmica i altres tecnologies. 

Lamplificació isotèrmica mediada per oop

El principi d'amplificació es basa en el fet que l'ADN es troba en un estat d'equilibri dinàmic a uns 65 °C.Quan qualsevol cebador està aparellat per bases i s'estén a la part complementària de l'ADN de doble cadena, l'altra cadena es dissociarà i es convertirà en monocatenari.

A aquesta temperatura, l'ADN utilitza 4 cebadors específics per confiar en una ADN polimerasa de desplaçament de cadena per fer que la síntesi d'ADN de desplaçament de cadena s'autocirculi contínuament.

Primer determineu les 6 regions específiques F3, F2, F1, B1, B2, B3 del gen objectiu i, a continuació, dissenyeu 4 primers basats en aquestes 6 regions específiques (com es mostra a la figura següent):

L'imprimació interna cap endavant (FIP) es compon de F1c i F2.

L'imprimació interna cap enrere (BIP) es compon de B1c i B2, i TTTT s'utilitza com a espaiador al mig.

Els cebadors externs F3 i B3 estan compostos respectivament per regions F3 i B3 del gen objectiu.

En el sistema de reacció LAMP, la concentració de l'imprimació interior és diverses vegades la de l'imprimació externa.El cebador intern es combina primer amb la cadena de plantilla per sintetitzar una cadena complementària per formar una cadena doble d'ADN.Posteriorment, el cebador exterior es combina amb la cadena de plantilla per formar una cadena doble d'ADN.Sota l'acció de la BstDNA polimerasa, s'allibera la cadena complementària sintetitzada pel cebador intern.Després d'una sèrie de reaccions, la cadena complementària finalment forma una única cadena d'ADN amb una estructura de manuelles.

La mateixa cadena d'ADN d'estructura de manuelles s'utilitza com a plantilla per formar contínuament un ADN d'estructura de bucle de tija de transició amb un extrem obert.Els cebadors interns i externs guien l'ADN de l'estructura de bucle de tija de transició per experimentar contínuament reaccions de desplaçament i extensió de cadena i, finalment, formen múltiples estructures de bucle de tija amb diferents longituds.mescla d'ADN.

Avantatges i desavantatges de l'amplificació isotèrmica mediada per bucle

Avantatges de LAMP:

(1) Alta eficiència d'amplificació, que pot amplificar eficaçment 1-10 còpies del gen objectiu en 1 h, i l'eficiència d'amplificació és de 10-100 vegades la de la PCR ordinària.

(2) El temps de reacció és curt, l'especificitat és forta i no es requereix cap equip especial.

Deficiències de LAMP:

(1) Els requisits per a imprimacions són especialment elevats.

(2) El producte amplificat no es pot utilitzar per a la clonació i la seqüenciació, però només es pot utilitzar per a judici.

(3) A causa de la seva forta sensibilitat, és fàcil formar aerosols, provocant falsos positius i afectant els resultats de la prova.

Samplificació de desplaçament de trand

L'amplificació per desplaçament de cadena (SDA) és una tècnica d'amplificació d'ADN isotèrmica in vitro basada en la reacció enzimàtica proposada per primera vegada per l'estudiós nord-americà Walker el 1992.

El sistema bàsic de l'SDA inclou una endonucleasa de restricció, una ADN polimerasa amb activitat de desplaçament de cadena, dos parells d'encebadors, dNTP i ions de calci i magnesi i sistemes tampó.

El principi de l'amplificació per desplaçament de cadena es basa en la seqüència de reconeixement d'endonucleases de restricció modificada químicament als dos extrems de l'ADN diana.L'endonucleasa obre el buit a l'ADN de la cadena al seu lloc de reconeixement, i l'ADN polimerasa amplia l'extrem 3′ de la bretxa i substitueix la següent cadena d'ADN.

Les cadenes simples d'ADN substituïdes es poden combinar amb cebadors i estendre's en cadenes dobles per l'ADN polimerasa.Aquest procés es repeteix contínuament, de manera que la seqüència objectiu s'amplifica de manera eficient.

Avantatges i desavantatges de la tecnologia d'amplificació per desplaçament de fil

Avantatges de SDA:

L'eficiència d'amplificació és alta, el temps de reacció és curt, l'especificitat és forta i no es requereix cap equip especial.

Deficiències de SDA:

Els productes no són uniformes, i alguns productes monocatenaris i de doble cadena sempre es produeixen en el cicle SDA, i es produirà una cua inevitable quan es detecti per electroforesi.

Ramplificació del cercle olling

L'amplificació de cercle rodant (RCA) es proposa basant-se en el mètode de copiar l'ADN d'organismes patògens mitjançant un cercle rodant.Es refereix a l'ús d'ADN circular monocatenari com a plantilla a temperatura constant i una ADN polimerasa especial (com Phi29) sota l'acció de la síntesi d'ADN en cercle rodant per aconseguir l'amplificació del gen objectiu.

RCA es pot dividir en amplificació lineal i amplificació exponencial.L'eficiència del RCA lineal pot arribar a 10⁵vegades, i l'eficiència de RCA exponencial pot arribar a 10⁹vegades.

Distinció simple, tal com es mostra a la figura següent, l'amplificació lineal a només utilitza 1 cebador, l'amplificació exponencial b té 2 cebadors.

L'RCA lineal també s'anomena RCA d'encebador únic.Un cebador s'uneix a l'ADN circular i s'estén per l'acció de l'ADN polimerasa.El producte és una cadena simple lineal amb un gran nombre de seqüències repetitives milers de vegades la longitud d'un sol bucle.

Com que el producte de RCA lineal sempre està connectat a l'encebador inicial, la fàcil fixació del senyal és un avantatge important.

RCA exponencial, també conegut com a HRCA d'amplificació hiperramificada (RCA hiperramificada), en RCA exponencial, un cebador amplifica el producte RCA, el segon cebador s'hibrida amb el producte RCA i s'estén, i el reemplaçament ja està unit al producte RCA.

Els avantatges i els desavantatges de l'amplificació d'àcids nucleics en cercle rodant

Avantatges de RCA:

Alta sensibilitat, bona especificitat i fàcil operació.

Deficiències de RCA:

Problemes de fons durant la detecció del senyal.Durant la reacció RCA, la sonda de cadenat sense circular i l'ADN o ARN de plantilla de la sonda no lligada poden generar alguns senyals de fons. 

Namplificació basada en la seqüència de l'àcid ucleic

L'amplificació basada en seqüències d'àcids nucleics (NASBA) és una nova tecnologia desenvolupada a partir de la PCR.És una amplificació contínua i isotèrmica d'àcids nucleics guiada per un parell d'encebadors amb una seqüència promotora T7.La tecnologia pot amplificar l'ARN plantilla unes 109 vegades en unes 2 hores, que és 1000 vegades més gran que el mètode de PCR convencional i no requereix equips especials.

Aquesta tecnologia s'ha utilitzat per al diagnòstic ràpid de malalties tan bon punt va aparèixer, i actualment moltes empreses utilitzen aquest mètode en kits de detecció d'ARN.

Tot i que l'amplificació d'ARN també pot utilitzar la tecnologia PCR de transcripció inversa, NASBA té els seus propis avantatges: es pot dur a terme en condicions de temperatura relativament constants i és més estable i precisa que la tecnologia PCR tradicional.

La reacció és a 41 graus centígrads i requereix transcriptasa inversa AMV (virus de la mieloblastosi aviar), RNasa H, ARN polimerasa T7 i un parell d'encebadors per completar-se.

El procés inclou principalment:

El cebador directe conté la seqüència complementària del promotor T7.Durant la reacció, el cebador directe s'uneix a la cadena d'ARN i és catalitzat per l'enzim AMV per formar una doble cadena ADN-ARN.

La RNasa H digereix l'ARN a l'híbrid de doble cadena i reté l'ADN monocatenari.

Sota l'acció de l'encebador invers i de l'enzim AMV, es forma una doble cadena d'ADN que conté la seqüència del promotor T7.

Sota l'acció de l'ARN polimerasa T7, es completa el procés de transcripció i es produeix una gran quantitat d'ARN diana.

Avantatges de NASBA:

(1) El seu cebador té una seqüència promotora T7, però l'ADN de doble cadena estrany no té una seqüència promotora T7 i no es pot amplificar, de manera que aquesta tecnologia té una alta especificitat i sensibilitat.

(2) NASBA incorpora directament el procés de transcripció inversa a la reacció d'amplificació, escurçant el temps de reacció.

Desavantatges de NASBA:

(1) Els components de la reacció són més complicats.

(2) Es necessiten tres tipus d'enzims per augmentar el cost de la reacció.