1. Detectar l'absorbància de la solució d'ARN
L'absorbància a 280, 320, 230 i 260 nm representa els valors d'àcid nucleic, fons (terbolesa de la solució), concentració de sal i matèria orgànica com la proteïna, respectivament.En general, només mireu OD260/OD280 (Ratio, R).Quan 1,8 ~ 2,0, pensem que es pot tolerar la contaminació de proteïnes o altres matèria orgànica a l'ARN, però cal tenir en compte que quan s'utilitza Tris com a tampó per detectar l'absorbància, el valor R pot ser superior a 2 (generalment hauria de ser <2,2).Quan R<1,8, la contaminació de proteïnes o altres matèries orgàniques a la solució és més evident i el destí de l'ARN es pot determinar segons les necessitats.Quan R>2,2, vol dir que l'ARN s'ha hidrolitzat en un àcid nucleic únic.
2.Patró electroforètic de l'ARN
Generalment, el gel desnaturalitzant s'utilitza per a l'electroforesi d'ARN, però si només és per detectar la qualitat de l'ARN, el gel desnaturalitzant no és necessari i es pot utilitzar gel d'agarosa normal.El propòsit de l'electroforesi és detectar la integritat de les bandes 28S i 18S i la seva relació, o la integritat del frotis d'ARNm.En general, si les bandes 28S i 18S són brillants, clares i nítides (en referència a les vores de les bandes són clares) i la brillantor de 28S és més del doble que la de la banda 18S, considerem que la qualitat de l'ARN és bona.
Els anteriors són els dos mètodes que utilitzem habitualment, però cap d'aquests dos mètodes ens pot dir clarament si hi ha RNasa residual a la solució d'ARN.Si hi ha una quantitat molt petita de RNasa a la solució, és difícil per a nosaltres detectar-la amb el mètode anterior, però la majoria de les reaccions enzimàtiques posteriors es duen a terme a més de 37 graus i durant molt de temps.D'aquesta manera, si hi ha una quantitat molt petita d'RNasa a la solució d'ARN, llavors hi haurà un entorn i un temps molt adequats per jugar el seu paper en els experiments posteriors i, per descomptat, l'experiment estarà fred en aquest moment.A continuació introduïm un mètode que pot confirmar si hi ha RNasa residual a la solució d'ARN.
3. Prova de conservació de la calor
D'acord amb la concentració de la mostra, extreu dos 1000 ng d'ARN de la solució d'ARN i afegiu-los a un tub de centrífuga de 0,5 ml i complementeu-lo amb tampó Tris de pH 7,0 fins a un volum total de 10 ul i, a continuació, tanqueu la tapa del tub.Poseu-ne un en un bany maria a temperatura constant a 70°C i mantingueu-lo calent durant 1 h.L'altra part es va guardar en una nevera a -20 °C durant 1 h.Quan s'acabi el temps, traieu les dues mostres per a l'electroforesi.Un cop completada l'electroforesi, compareu les bandes electroforètiques de les dues.Si les bandes de les dues són consistents o no tenen cap diferència significativa (per descomptat, les seves bandes també compleixen les condicions del mètode 2), vol dir que no hi ha contaminació residual de RNasa a la solució d'ARN i la qualitat de l'ARN és molt bona.Per contra, si la mostra incubada a 70 °C presenta una degradació evident, indica que hi ha contaminació per RNasa a la solució d'ARN.
2 Mètodes i tècniques experimentals d'extracció d'ARN
Els problemes que sovint ens trobem a l'hora d'extreure l'ARN són: (1) el rendiment d'ARN és baix;(2) L'ARN té una greu contaminació per sal;(3) L'ARN té una greu contaminació per dissolvents orgànics;(4) degradació de la mostra i altres problemes
1. Reactius d'extracció d'ARN total d'ús habitual
El mètode d'isotiocianat de guanidina i el mètode de Trizol són els mètodes més utilitzats per a l'extracció d'ARN total de teixits animals i cèl·lules animals.És especialment adequat per a mostres petites i teixits especialment difícils d'extreure, com ara l'extracció d'ARN total de pell de conill i teixit connectiu animal;a més, Trizol, com a reactiu de lisi d'ús general, també es pot utilitzar per a l'extracció de teixits vegetals, bacteris, fongs i altres teixits.Per als teixits vegetals que contenen polisacàrids i polifenols, com ara camellia oleifera, fulles de te, colza, etc., el mètode CTAB també es pot utilitzar per extreure ARN total.
Com a mètode convencional, el mètode de doble columna també és molt popular a causa del seu funcionament a temperatura normal, sense necessitat d'afegir RNasa i seguretat: sense cloroform, fenols i altres reactius orgànics per a l'extracció.(productes recomanats )
2. Extracció d'ARN total de teixits animals
(1) Intenta triar teixit fresc, si no és fresc (preferiblement en un termini de tres mesos - refrigerador de 80 ℃ o congelat en nitrogen líquid. Quan talleu teixit, no talleu directament a temperatura ambient, assegureu-vos de posar-lo a la caixa de gel, intenta evitar la congelació i descongelació repetida.
(2) Utilitzeu tisores i pinces netes per tallar un petit tros de teixit, intenteu tallar la part central del teixit quan talleu la mostra o primer talleu el tros gran de teixit des del mig i, a continuació, talleu la mostra a la posició d'incisió fresca.El teixit eliminat s'ha de triturar completament, posar el teixit triturat en un tub EP sense RNasa, afegir el lisat, el teixit triturat s'ha d'exposar completament al lisat i preparar-se per a l'homogeneïtzació.
(3) Per a teixits normals, seleccioneu teixits de mida de mongeta mung (30-60 mg) per a l'homogeneïtzació.Si els teixits contenen una gran quantitat de proteïnes, greixos o teixits fibrosos densos com el fetge, augmenteu o reduïu adequadament la quantitat de teixits tallats (opcional) Trieu 10 ~ 20 mg).
(4) Si s'extreu múscul de peix, carn de gambes, meduses i altres teixits amb un alt contingut d'aigua, s'ha d'augmentar adequadament el volum de mostra (recomanat 100-200 mg).
(5) Si les condicions ho permeten, el teixit animal es pot extreure directament després d'haver estat homogeneïtzat amb un homogeneïtzador de teixits de pas alt, si no hi ha aquest equip.
(6) L'ARN obtingut després de l'extracció final s'ha de col·locar immediatament a la caixa de gel per reduir la degradació de l'ARN.
3. Extracció d'ARN de cèl·lules animals
(1) Cèl·lules de suspensió: centrifugar directament i descartar el medi, rentar amb PBS estèril durant 1-2 vegades, després suspendre amb una quantitat adequada de PBS i després afegir lisat per a la lisi.No afegiu el lisat directament a les cèl·lules precipitades després de descartar completament el líquid.Això farà que el paquet d'histona alliberat després que les cèl·lules lisades de la capa externa s'adhereixin a l'exterior de les cèl·lules precipitades, limitant així el contacte de les cèl·lules dins del pellet amb el lisat., donant lloc a una lisi cel·lular incompleta i un rendiment reduït d'ARN.
(2) Cèl·lules semiadherents o no molt adherides: després de descartar el medi, renteu-vos amb PBS 1-2 vegades, després absorbiu directament una quantitat adequada de PBS i bufeu el plat de cultiu amb una pipeta o una pistola per treure les cèl·lules i transferir-les a cèl·lules lliures d'ARN.Afegiu el lisat al tub EP de l'enzim per a l'extracció.
(3) Cèl·lules adherents: primer s'han de digerir amb tripsina, després recollir-les en tubs EP lliures de RNasa, centrifugar per eliminar el sobrenedant, rentar 1-2 vegades amb PBS per eliminar l'excés de tripsina i tornar a suspendre amb una quantitat adequada de PBS. A continuació, procediu al pas d'extracció.
4. Extracció d'ARN vegetal
Els teixits vegetals són rics en compostos fenòlics, o rics en polisacàrids, o contenen alguns metabòlits secundaris no identificats, o tenen una alta activitat de la RNasa.Aquestes substàncies es combinen fortament amb l'ARN després de la lisi cel·lular per formar complexos insolubles o precipitats col·loïdals, que són difícils d'eliminar.Per tant, quan extraem teixit vegetal, hem de triar un kit per a plantes.El lisat del kit pot resoldre eficaçment els problemes de fàcil oxidació dels polifenols i la separació de compostos de polisacàrids i àcids nucleics.
(Per a l'extracció d'ARN de plantes polisacàrids polifenols, productes recomanats:
(1) La pela, la polpa, les llavors, les fulles, etc. de la planta s'han de mòltar completament en un morter.Durant el procés de mòlta, el nitrogen líquid s'ha de reposar a temps per evitar que es fongui la mostra.La mostra mòlta s'ha d'afegir ràpidament al lisat i agitar-la per evitar la degradació de l'ARN.
(2) Per a mostres riques en fibra, com ara les fulles d'arròs i blat, la quantitat d'extracció s'ha de reduir adequadament, en cas contrari, la mòlta i la lisi dels teixits no es completaran, donant lloc a un baix rendiment d'ARN extret.
(3) Per als teixits vegetals amb alt contingut d'aigua, com ara fruita de magrana, fruita de síndria, fruita de préssec, etc., la mida de la mostra s'ha d'augmentar adequadament (100-200 mg és opcional).
(4) Els teixits vegetals, com ara fulles de plantes, rizomes, fruits durs i altres materials, generalment es recomana utilitzar nitrogen líquid per morter a fons els ingredients en un morter i, a continuació, procedir a l'etapa d'extracció.Els homogeneïtzadors de teixits convencionals poden no ser efectius per homogeneïtzar teixits vegetals i, en general, no es recomana.
5. Precaucions per a l'extracció d'ARN
(1) Les mostres de teixit han d'estar tan fresques com sigui possible per evitar la congelació i la descongelació repetides.
(2) El teixit s'ha de mòltar completament durant l'extracció i la quantitat de teixit no ha de ser massa petita, i molt menys massa.
(3) S'ha de donar un temps d'incubació suficient després d'afegir el lisat per lisar completament la mostra.
(4) Quan s'utilitza el mètode Trizol per a l'extracció, el principi d'absorció del sobrenedant després de l'estratificació és "preferir inhalar menys que inhalar més" i no s'ha d'extreure a la capa mitjana, en cas contrari, provocarà una contaminació greu de l'ADN genòmic.
(5) Quan es renta, el líquid de rentat s'ha d'infiltrar completament al voltant de la paret del tub per garantir un rentat a fons.
(6) Per al mètode d'extracció de columna, a més de separar la columna després del rentat, la columna d'adsorció també s'ha de col·locar en un banc ultra net i bufar durant 5-10 minuts per evaporar completament el dissolvent orgànic fins a la sequedat.
(7) A l'última elució del mètode de columna, després d'afegir aigua DEPC, s'ha d'incubar durant 3-5 minuts, o l'aigua DEPC s'ha d'escalfar a 60 ° C per endavant per augmentar el rendiment d'elució.En el mètode tradicional de divisió Trizol i precipitació d'isopropanol, l'ARN final es dissol en aigua DEPC, de manera que s'ha de donar un temps adequat per a la dissolució i la part inferior del tub de la centrífuga s'ha de bufar contínuament amb una punta de pipeta.
3 Taquí Causes i solucions per a baixa concentració d'ARN/mala qualitat
1. El rendiment és massa baix
La mostra extreta és massa baixa, la quantitat total és insuficient o la mostra extreta és massa i la lisi no és completa;s'ha d'utilitzar el teixit o cèl·lules de qualitat adequada per a l'extracció, el pretractament de la mostra s'ha de fer bé i la lisi ha de ser suficient.
2. Residus del genoma
Quan s'extreu pel mètode Trizol, quan el sobrenedant s'aspira a la capa mitjana després de la capa, es produirà una contaminació greu del genoma;S'ha de tenir molta cura a l'hora de fer capes per evitar xuclar a la capa mitjana.Si s'utilitza el mètode de columna per a l'extracció, es pot seleccionar un kit que contingui DNasa I per a l'extracció.L'àcid nucleic adsorbit a la membrana es digereix directament amb la DNasa I, que pot reduir molt els residus d'ADN.
3. Degradació de l'ARN
Pot ser la degradació de la pròpia mostra extreta, o la degradació provocada durant el procés d'extracció;En la mesura del possible, s'han d'utilitzar mostres fresques per a l'extracció d'ARN, i les mostres recollides s'han d'emmagatzemar en nitrogen líquid o refrigerador a -80 ° C a temps, i s'ha d'evitar la congelació i descongelació repetida.En el procés d'extracció d'ARN s'han d'utilitzar puntes lliures de RNasa/DNasa, tubs de centrífuga i altres materials.El procés d'extracció ha de ser el més ràpid possible.L'ARN extret s'ha de col·locar en una caixa de gel i emmagatzemar a -80 en el temps.Si l'ARN extret s'ha de detectar mitjançant electroforesi en gel, l'electroforesi s'ha de realitzar immediatament després de l'extracció i el tampó d'electroforesi s'ha de substituir per un de nou preparat.
4. Residus de sal i dissolvents orgànics
Els reactius d'extracció contenen sals de fenol i guanidina, i la solució de rentat conté etanol.Durant el procés d'extracció, el lisat no es va absorbir i rebutjar completament, i la solució de rentat no es va assecar completament.Les sals residuals i els dissolvents orgànics són perjudicials per a la transcripció inversa i la PCR posteriors.Diferents graus d'inhibició, de manera que el lisat de teixit s'ha d'eliminar completament durant el procés d'extracció i el rentat ha de ser suficient perquè les parets circumdants del tub es puguin rentar.A més, el tub es buida i es bufa és un pas necessari, que reduirà encara més el residu de matèria orgànica.
Per obtenir més informació sobre l'extracció d'ARN, seguiu el nostre lloc web:
www.foreivd.com per a més informació.
Hora de publicació: 01-12-2022
