La PCR quantitativa de fluorescència (també coneguda com a PCR TaqMan, d'ara endavant denominada FQ-PCR) és una nova tecnologia quantitativa d'àcids nucleics desenvolupada per PE (Perkin Elmer) als Estats Units l'any 1995. Aquesta tecnologia es basa en la PCR convencional afegint sondes marcades fluorescents.En comparació amb la PCR flexible, la FQ-PCR té molts avantatges per realitzar la seva funció quantitativa.Aquest article pretén descriure breument les característiques, principis, mètodes i aplicacions de la tecnologia.
1 Característiques
FQ-PCR no només té l'alta sensibilitat de la PCR ordinària, sinó que també a causa de l'aplicació de sondes fluorescents, pot detectar directament el canvi de senyal fluorescent durant l'amplificació de la PCR mitjançant el sistema de conducció fotoelèctrica per obtenir resultats quantitatius, cosa que supera moltes deficiències de la PCR convencional, de manera que també té l'alta especificitat de la hibridació d'ADN i l'alta precisió de la tecnologia d'espectroscòpia.
Per exemple, els productes generals de PCR s'han d'observar mitjançant electroforesi en gel d'agarosa i tinció de bromur d'etidi amb llum ultraviolada o per electroforesi en gel de poliacrilamida i tinció de plata.Això no només requereix múltiples instruments, sinó que també requereix temps i esforç.Les taques utilitzades de bromur d'etidi són perjudicials per al cos humà, i aquests complicats procediments experimentals ofereixen oportunitats de contaminació i falsos positius.Tanmateix, FQ-PCR només necessita obrir la tapa una vegada durant la càrrega de la mostra, i el procés posterior és un funcionament de tub completament tancat, que no requereix postprocessament de PCR, evitant molts inconvenients en les operacions de PCR convencionals.L'experiment utilitza generalment el termociclador ABI7100 PCR desenvolupat per l'empresa PE.
L'instrument té les característiques següents: ① Àmplia aplicació: es pot utilitzar per a la quantificació de productes de PCR d'ADN i ARN, investigació d'expressió gènica, detecció de patògens i optimització de les condicions de PCR.② Principi quantitatiu únic: utilitzant sondes marcades amb fluorescència, la quantitat de fluorescència s'acumularà amb el cicle de PCR després de l'excitació làser, per tal d'aconseguir el propòsit de la quantificació.③ Alta eficiència de treball: termociclador 9600 PCR integrat, controlat per ordinador d'1 a 2 hores per completar l'amplificació i la quantificació de 96 mostres de forma automàtica i sincrònica.④ No cal electroforesi en gel: no cal diluir i electroforesi la mostra, només cal que utilitzeu una sonda especial per detectar directament al tub de reacció.⑤No hi ha contaminació a la canonada: s'adopten l'únic tub de reacció totalment tancat i el sistema de conducció fotoelèctrica, de manera que no cal preocupar-se per la contaminació.⑥Els resultats són reproduïbles: el rang dinàmic quantitatiu és de fins a cinc ordres de magnitud.Per tant, com que aquesta tecnologia es va desenvolupar amb èxit, ha estat valorada per molts investigadors científics i s'ha aplicat en molts camps.
2 Principis i mètodes
El principi de funcionament de la FQ-PCR és utilitzar l'activitat exonucleasa 5'→3' de l'enzim Taq per afegir una sonda marcada fluorescentment al sistema de reacció de PCR.La sonda es pot hibridar específicament amb la plantilla d'ADN continguda a la seqüència de cebador.L'extrem 5'de la sonda s'etiqueta amb el gen d'emissió de fluorescència FAM (6-carboxifluoresceïna, pic d'emissió de fluorescència a 518 nm), i l'extrem 3' està etiquetat amb el grup d'extinció de la fluorescència TAMRA (6-carboxitetrametilrodamina, 5-carboxifluoresceïna, el pic d'emissió de fluorescència de 83'2'beak de fosforamina a la sonda 5832'beak). evitar que la sonda s'estengui durant l'amplificació per PCR.Quan la sonda roman intacta, el grup extintor suprimeix l'emissió de fluorescència del grup emissor.Un cop separat el grup emissor del grup d'extinció, la inhibició s'aixeca i la densitat òptica a 518 nm augmenta i és detectada pel sistema de detecció de fluorescència. En la fase de renaturació, la sonda s'hibrida amb l'ADN plantilla, i l'enzim Taq en la fase d'extensió es mou al llarg de la plantilla d'ADN amb l'extensió de l'encebador.Quan es talla la sonda, s'allibera l'efecte d'extinció i s'allibera el senyal fluorescent.Cada cop que es copia la plantilla, es talla una sonda, acompanyada de l'alliberament d'un senyal fluorescent.Com que hi ha una relació un a un entre el nombre de fluoròfors alliberats i el nombre de productes de PCR, aquesta tècnica es pot utilitzar per quantificar amb precisió la plantilla.L'instrument experimental utilitza generalment el termociclador ABI7100 PCR desenvolupat per l'empresa PE, i també es poden utilitzar altres termocicladors.Si s'utilitza el sistema de reacció de tipus de reacció ABI7700 per a l'experiment, un cop finalitzada la reacció, els resultats quantitatius es poden donar directament mitjançant l'anàlisi per ordinador.Si utilitzeu altres termocicladors, heu d'utilitzar un detector de fluorescència per mesurar el senyal de fluorescència al tub de reacció alhora per calcular RQ+, RQ-, △RQ.RQ + representa la relació entre la intensitat de la luminiscència del grup d'emissió fluorescent del tub de mostra i la intensitat de la luminescència del grup d'extinció, RQ- representa la proporció de les dues al tub en blanc, △RQ (△RQ = RQ + -RQ-) representa la quantitat de canvi de senyal de fluorescència durant la PCR, es poden obtenir resultats quantitatius.A causa de la introducció de sondes fluorescents, l'especificitat de l'experiment es millora significativament.El disseny de la sonda en general ha de complir les condicions següents: ①La longitud de la sonda ha de ser d'unes 20-40 bases per garantir l'especificitat de la unió.②El contingut de bases GC està entre el 40% i el 60% per evitar la duplicació de seqüències de nucleòtids individuals.③ Eviteu la hibridació o la superposició amb imprimadors.④ L'estabilitat de la unió entre la sonda i la plantilla és més gran que l'estabilitat de la unió entre l'imprimació i la plantilla, de manera que el valor de Tm de la sonda hauria de ser almenys 5 ° C superior al valor de Tm de l'imprimació.A més, la concentració de la sonda, l'homologia entre la sonda i la seqüència de plantilla i la distància entre la sonda i l'encebador tenen un impacte en els resultats experimentals.
Productes relacionats:
Xina Real Time PCR Easyᵀᴹ-Taqman Fabricant i proveïdor |Foregene (foreivd.com)
Hora de publicació: 15-octubre-2021
