La verificació del rendiment dels primers i les sondes en la fase inicial dels reactius de PCR i la determinació de les condicions de reacció més adequades són els requisits previs per garantir el bon progrés dels experiments formals.
Llavors, com hem de confirmar la sonda d'imprimació en una fase inicial?
Els principals indicadors són la línia de base, la corba d'amplificació, el valor ct, l'eficiència de l'amplificació, la detecció de mostres de baixa concentració, el CV, etc.
Línia de base
La línia de base és la línia horitzontal de la corba d'amplificació de la PCR.En els primers cicles de la reacció d'amplificació de la PCR, el senyal de fluorescència no canvia gaire i forma una línia recta.Aquesta línia recta és la línia de base.
Quan examineu les sondes d'imprimació de PCR, presteu atenció a si la línia de base és a nivell.La puresa de la concentració de la sonda de cebador afectarà la línia de base, com ara provocar que la línia de base pugi o baixi.La línia de base també és un indicador molt intuïtiu.
Corba d'amplificació
Un altre indicador intuïtiu és la forma de la corba d'amplificació.El millor és tenir una corba en forma de S per evitar l'amplificació secundària o altres corbes d'amplificació anormals.
Valor Ct
El nombre de cicles corresponents al punt d'inflexió des de la línia de base fins al creixement exponencial és el valor Ct.
Per a la mateixa mostra, diferents sondes d'encebació donen lloc a diferents corbes d'amplificació, i el valor Ct corresponent es veurà afectat per l'eficiència de l'amplificació i el grau d'interferència.En teoria, com més petit sigui el valor Ct de la sonda d'imprimació que triem, millor.
Eficiència d'amplificació
Un dels mètodes més fiables i estables per avaluar l'eficiència de l'amplificació de la PCR és la corba estàndard, que també és àmpliament reconeguda pels investigadors.El mètode consisteix a fer una sèrie de mostres per controlar el nombre relatiu de plantilles objectiu.Aquestes mostres es fan normalment per dilucions en sèrie de solucions concentrades, la més utilitzada és la dilució de 10 vegades.Utilitzant una sèrie de mostres diluïdes, utilitzant el programa qPCR estàndard per amplificar per obtenir el valor Cq, i finalment dibuixar una corba estàndard segons la concentració de cada mostra i el valor Cq corresponent per obtenir l'equació lineal Cq= -klgX0+b, i l'eficiència d'amplificació E=10(-1 /k)-1.Quan s'utilitza qPCR per a l'anàlisi quantitativa, l'eficiència d'amplificació ha d'estar en el rang del 90% al 110% (3,6>k>3,1).
Detecció de mostres de baixa concentració
Quan la concentració de la mostra és baixa, les taxes de detecció de diferents sondes d'encebació són diferents.Seleccionem 20 mostres de baixa concentració per replicar, i el sistema d'imprimació-sonda amb la taxa de detecció més alta és el millor.
Coeficient de variació (CV)
Es poden detectar 10 mostres duplicades amb diferents sondes d'encebador segons l'estàndard de línia del reactiu per a la detecció d'amplificació d'àcid nucleic.
Reactius quantitatius:
Precisió
La precisió dins d'un lot s'ha de complir: el coeficient de variació (CV,%) del valor logarítmic de la concentració de prova és ≤5%.Quan la concentració de la mostra és baixa, el coeficient de variació (CV,%) del logaritme de la concentració de detecció és ≤10%
Reactius qualitatius:
Precisió
La precisió d'un lot ha de complir:
(1) Coeficient de variació del valor Ct (CV,%) ≤5%
La mateixa mostra es prova en paral·lel durant 10 vegades i els resultats de la prova han de ser coherents
Hora de publicació: 18-set-2021
