En les primeres fases del brot, a causa del ràpid desenvolupament, el diagnòstic ràpid dels pacients sospitosos és la clau per prevenir la COVID-19.Alguns reactius de detecció d'àcids nucleics aprovats tenen un temps de desenvolupament curt i hi ha problemes com ara la confirmació del rendiment precipitada, l'optimització insuficient de reactius i grans diferències entre lots;Els problemes de diversos laboratoris clínics en diversos aspectes del procés de detecció d'àcids nucleics també poden afectar la precisió dels resultats de la detecció d'àcids nucleics.Aquest article se centrarà en els enllaços i punts clau en la detecció actual d'àcids nucleics SARS-CoV-2 i analitzarà els problemes de reexamen positiu i fals negatiu de la detecció d'àcid nucleic de laboratori i la inconsistència clínica.

Principis de detecció d'àcids nucleics SARS-CoV-2

El SARS-CoV-2 és un virus d'ARN amb una seqüència del genoma d'uns 29 kb, amb 10 gens, que poden codificar efectivament 10 proteïnes.Els virus estan formats per ARN i proteïnes, i la capa més externa és una capa externa composta per lípids i glicoproteïnes.A l'interior, la càpsida proteica embolica l'ARN, protegint així l'ARN fàcilment degradable (P1).

P1 Estructura del SARS-COV-2

Els virus envaeixen les cèl·lules mitjançant receptors específics de la superfície cel·lular per causar infecció i utilitzen cèl·lules hoste per replicar-se.

El principi de detecció d'àcids nucleics virals és exposar l'ARN viral a través d'un lisat cel·lular i, a continuació, utilitzar la reacció en cadena de la polimerasa de transcripció inversa fluorescent en temps real (RT-PCR) per a la detecció.

La clau del principi de detecció és utilitzar cebadors i sondes per aconseguir una "concordança dirigida" de seqüències d'àcids nucleics, és a dir, trobar la seqüència d'àcids nucleics del SARS-CoV-2 que és diferent d'altres virus en unes 30.000 bases (la semblança de l'àcid nucleic amb altres virus) zona "Baixa"), dissenyar cebadors i sondes.

Els cebadors i les sondes estan molt relacionats amb la regió específica de l'àcid nucleic SARS-CoV-2, és a dir, l'especificitat és molt forta.Una vegada que el resultat d'amplificació RT-PCR fluorescent en temps real de la mostra a provar és positiu, demostra que el SARS-CoV-2 està present a la mostra.Veure P2.

P2 Etapes de determinació d'àcid nucleic SARS-CoV-2 (RT-PCR fluorescent en temps real)

Condicions i requisits del laboratori per a la detecció d'àcids nucleics SARS-CoV-2

Els laboratoris de proves d'àcids nucleics són els més ideals per a entorns de pressió negativa i haurien de prestar atenció al control de la pressió, mantenir el flux d'aire i eliminar els aerosols.El personal de proves d'àcids nucleics ha de tenir les qualificacions corresponents, rebre la formació pertinent sobre reacció en cadena de la polimerasa i superar l'avaluació.El laboratori s'ha de gestionar estrictament, s'ha de dividir en zones, i està totalment prohibit l'entrada de personal irrellevant.La zona neta s'ha de ventilar i desinfectar al seu lloc.Els articles rellevants es col·loquen a les zones, es separen nets i bruts, es substitueixen a temps i es descontaminan al seu lloc.Desinfecció rutinària: el desinfectant que conté clor és la solució principal per a àrees més grans i es pot utilitzar un 75% d'alcohol per a àrees petites.Una bona manera de fer front als aerosols és obrir finestres per a la ventilació, i també es pot fer la desinfecció de l'aire mitjançant raigs ultraviolats, filtració i desinfecció de l'aire.

Enllaços i paràmetres clau de la determinació de l'àcid nucleic SARS-CoV-2 (RT-PCR fluorescent en temps real)

Tot i que els laboratoris solen prestar molta atenció a la "detecció" d'àcids nucleics, de fet, l'"extracció" d'àcids nucleics també és un dels passos clau per a una detecció reeixida, que està estretament relacionada amb la recollida i l'emmagatzematge de mostres de virus.

Actualment, les mostres respiratòries més utilitzades, com els hisops nasofaríngies, utilitzen el segon mètode, que és una solució d'inactivació (conservació) preparada a partir d'extracció d'àcids nucleics i solució de lisi.D'una banda, aquesta solució de preservació del virus pot desnaturalitzar la proteïna del virus, perdre la seva activitat i deixar de ser infecciosa i millorar la seguretat de l'etapa de transport i detecció;d'altra banda, pot trencar directament el virus per alliberar l'àcid nucleic, eliminar l'enzim que descompone l'àcid nucleic i prevenir el virus.L'ARN es degrada.

Una solució de mostreig de virus preparada a partir d'una solució de lisi d'extracció d'àcids nucleics.Els components principals són sals equilibrades, agent quelant de l'àcid etilendiaminotetraacètic, sal de guanidina (isotiocianat de guanidina, clorhidrat de guanidina, etc.), tensioactiu aniònic (dodecà) sulfat de sodi), tensioactiu catiònic (oxalat de tetradecil trimetil amoni), fenol, proteïna 8-hidrotixitol i diversos components, 8.Actualment, hi ha molts tipus de kits d'extracció d'àcids nucleics i s'utilitzen diferents reactius d'extracció i purificació d'àcids nucleics.Fins i tot si s'utilitza el mateix reactiu d'extracció i purificació d'àcids nucleics, els procediments d'extracció de cada kit són diferents.

Actualment, els productes del kit de detecció d'àcids nucleics aprovats per la National Medical Products Administration es seleccionen en funció dels gens ORF1ab, E i N del genoma SARS-CoV-2.Els principis de detecció de diferents productes són bàsicament els mateixos, però els seus primers i dissenys de sondes són diferents.Hi ha segments d'un sol objectiu (ORF1ab), segments de doble objectiu (ORF1ab, N o E) i segments de tres objectius (ORF1ab, N i E).La diferència entre la detecció i la interpretació, l'extracció d'àcids nucleics i el sistema de reacció RT-PCR fluorescent en temps real s'ha de referir a les instruccions del kit pertinents, i es recomana que els usuaris segueixin estrictament el mètode d'interpretació especificat a les instruccions del kit per a la interpretació.Les regions comunes, els primers i les seqüències de sondes amplificades per RT-PCR fluorescent en temps real es mostren a P3.

P3 La ubicació de l'objectiu de l'amplicó SARS-CoV-2 al genoma i la seqüència d'encebadors i sondes

Interpretació dels resultats de la determinació de l'àcid nucleic SARS-CoV-2 (Rmenjar-Time fluorescent RT-PCR)

"Pla de prevenció i control de la pneumònia per a la infecció per SARS-CoV-2 (segona edició)" va aclarir per primera vegada els criteris per jutjar els resultats de l'amplificació d'un sol gen:

1. Cap Ct o Ct≥40 és negatiu;

2. Ct<37 és positiu;

3. El valor Ct de 37-40 és l'àrea d'escala de grisos.Es recomana repetir l'experiment.Si el resultat de tornar a fer Ct<40 i la corba d'amplificació té pics evidents, la mostra es considera positiva, en cas contrari és negativa.

La tercera edició de la guia i la quarta edició de la guia van continuar amb els criteris anteriors.No obstant això, a causa dels diferents objectius utilitzats en els kits comercials, l'esmentada 3a edició de la guia no donava els criteris per determinar la combinació d'objectius, posant l'accent en les instruccions proporcionades pel fabricant.A partir de la cinquena edició de les directrius, s'han aclarit dos objectius, especialment els criteris de judici d'un únic objectiu difícil de jutjar.És a dir, si el laboratori vol confirmar que un cas és positiu per a la detecció d'àcid nucleic SARS-CoV-2, s'ha de complir una de les dues condicions següents:

(1) Dos objectius de SARS-CoV-2 (ORF1ab, N) a la mateixa mostra són positius mitjançant RT-PCR fluorescent en temps real.Si un únic objectiu és positiu, cal tornar a mostrejar i tornar a provar.Si els resultats de la prova són Si l'únic objectiu encara és positiu, es considera positiu.

(2) Dues mostres de RT-PCR fluorescent en temps real van mostrar un únic objectiu positiu al mateix temps o dues mostres del mateix tipus van mostrar un únic resultat positiu de la prova, que es pot jutjar com a positiu.Tanmateix, les directrius també subratllen que els resultats negatius de les proves d'àcid nucleic no poden excloure la infecció per SARS-CoV-2.S'han d'excloure els factors que poden provocar falsos negatius, com ara la mala qualitat de la mostra (mostres respiratòries de l'orofaringe i altres parts), la recollida de mostres massa aviat o massa tard, les mostres no es van emmagatzemar, transportar i processar correctament i la pròpia tecnologia va tenir problemes (variació del virus, inhibició de la PCR), etc.

Causes dels falsos negatius en la detecció del SARS-CoV-2

El concepte de "fals negatiu" en les proves d'àcid nucleic que es refereix actualment, sovint es refereix a "falsos negatius" en què els resultats de les proves d'àcid nucleic no són coherents amb les manifestacions clíniques, és a dir, els símptomes clínics i els resultats d'imatge són molt sospitats de COVID-19, però les proves d'àcid nucleic sempre són "negatius" moltes vegades.El Centre de Laboratori Clínic de la Comissió Nacional de Salut va explicar la prova del SARS-CoV-2 "fals negatiu".

(1) Hi ha una certa quantitat de virus a les cèl·lules de la persona infectada.Les dades existents mostren que després que el cos estigui infectat pel virus, el virus entra a la gola pel nas i la boca, després a la tràquea i els bronquis i després arriba als alvèols.La persona infectada experimentarà el període d'incubació, símptomes lleus i després el procés de símptomes greus i diferents etapes de la malaltia.I la quantitat de virus present en diferents parts del cos és diferent.

Pel que fa a la càrrega viral dels tipus cel·lulars, cèl·lules epitelials alveolars (tracte respiratori inferior)> cèl·lules epitelials de les vies respiratòries (vies respiratòries superiors)> fibroblasts, cèl·lules endotelials i macròfags, etc.;del tipus de mostra, líquid de rentat alveolar (el més excel·lent)>esput de tos profunda> hisop nasofarínge> hisop orofarínge>sang.A més, el virus també es pot detectar a les femtes.Tanmateix, tenint en compte la comoditat de l'operació i l'acceptació dels pacients, l'ordre de la mostra clínica d'ús habitual és el hisop orofarínge> hisop nasofarínge> líquid de rentat bronquial (operació complexa) i l'esput profund (generalment tos seca, difícil d'obtenir).

Per tant, la quantitat de virus a les cèl·lules de l'orofaringe o nasofaringe d'alguns pacients és petita o extremadament baixa.Si només es prenen mostres de l'orofaringe o la nasofaringe per a la prova, l'àcid nucleic viral no es detectarà.

(2) No es van recollir cèl·lules que contenen virus durant la recollida de mostres o no es va conservar de manera efectiva l'àcid nucleic viral.

[① Lloc de recollida inadequat, per exemple, quan es recullen hisops orofaríngs, la profunditat de recollida no és suficient, els hisops nasofaríngs recollits no es recullen profundament a la cavitat nasal, etc. La majoria de les cèl·lules recollides poden ser cèl·lules lliures de virus;

②Els hisops de mostreig s'utilitzen incorrectament.Per exemple, les fibres sintètiques com la fibra de PE, la fibra de polièster i la fibra de polipropilè es recomanen per al material del capçal de l'espallet.Les fibres naturals com el cotó s'utilitzen en el funcionament real (forta adsorció de proteïnes i no és fàcil de rentar) I fibres de niló (pobre absorció d'aigua, donant lloc a un volum de mostreig insuficient);

③ Ús incorrecte de tubs d'emmagatzematge de virus, com ara un mal ús de tubs d'emmagatzematge de plàstic de polipropilè o polietilè que són fàcils d'absorbir àcids nucleics (ADN/ARN), donant lloc a una disminució de la concentració d'àcid nucleic a la solució d'emmagatzematge.A la pràctica, es recomana utilitzar plàstic de polímer de polietilè-propilè i alguns envasos de plàstic de polipropilè especialment tractats per emmagatzemar àcids nucleics virals.]

[① Lloc de recollida inadequat, per exemple, quan es recullen hisops orofaríngs, la profunditat de recollida no és suficient, els hisops nasofaríngs recollits no es recullen profundament a la cavitat nasal, etc. La majoria de les cèl·lules recollides poden ser cèl·lules lliures de virus;

②Els hisops de mostreig s'utilitzen incorrectament.Per exemple, les fibres sintètiques com la fibra de PE, la fibra de polièster i la fibra de polipropilè es recomanen per al material del capçal de l'espallet.Les fibres naturals com el cotó s'utilitzen en el funcionament real (forta adsorció de proteïnes i no és fàcil de rentar) I fibres de niló (pobre absorció d'aigua, donant lloc a un volum de mostreig insuficient);

③ Ús incorrecte de tubs d'emmagatzematge de virus, com ara un mal ús de tubs d'emmagatzematge de plàstic de polipropilè o polietilè que són fàcils d'absorbir àcids nucleics (ADN/ARN), donant lloc a una disminució de la concentració d'àcid nucleic a la solució d'emmagatzematge.A la pràctica, es recomana utilitzar plàstic de polímer de polietilè-propilè i alguns envasos de plàstic de polipropilè especialment tractats per emmagatzemar àcids nucleics virals.]

(4) El funcionament del laboratori clínic no està estandarditzat.Les condicions de transport i emmagatzematge de la mostra, el funcionament normalitzat dels laboratoris clínics, la interpretació dels resultats i el control de qualitat són els factors clau per garantir la precisió i la fiabilitat dels resultats de les proves.Segons els resultats de l'avaluació externa de la qualitat realitzada pel Centre de Laboratori Clínic de la Comissió Nacional de Salut del 16 al 24 de març de 2020, dels 844 laboratoris que van rebre resultats vàlids, 701 (83,1%) estaven qualificats i 143 (16,9%) no.Qualificada, les condicions generals de proves de laboratori són bones, però els diferents laboratoris encara tenen diferències en la capacitat d'operació del personal, la capacitat d'interpretació de mostres positives d'un sol objectiu i el control de qualitat.

Com reduir el fals negatiu de la detecció d'àcid nucleic SARS-CoV-2?

La reducció de falsos negatius en la detecció d'àcids nucleics s'hauria d'optimitzar des dels quatre aspectes de la producció de falsos negatius.

(1) Hi ha una certa quantitat de virus a les cèl·lules de la persona infectada.La concentració del virus en diferents parts del cos de les persones sospitoses d'infectar serà diferent en diferents moments.Si no hi ha faringe, pot ser en líquid de rentat bronquial o femta.Si es poden recollir diversos tipus de mostres al mateix temps o en diferents etapes de progressió de la malaltia per a la prova, ajudarà a evitar falsos negatius.

(2) Les cèl·lules que contenen virus s'han de recollir durant la recollida de mostres.Aquest problema es pot resoldre en gran mesura reforçant la formació dels recol·lectors de mostres.

(3) Reactius IVD fiables.Realitzant investigacions sobre l'avaluació del rendiment de detecció de reactius a nivell nacional i discutint els problemes existents, es pot millorar encara més l'eficiència de detecció dels reactius i es pot millorar la sensibilitat de l'anàlisi.

(4) Funcionament normalitzat dels laboratoris clínics.Mitjançant l'enfortiment de la formació del personal del laboratori, la millora contínua del sistema de gestió de la qualitat del laboratori, la garantia de divisions raonables i la millora de la capacitat de detecció del personal, és possible reduir els falsos negatius a causa de les operacions inadequades del laboratori.

Motius per a la nova prova positiva de la prova d'àcid nucleic SARS-CoV-2 en pacients recuperats i donats d'alta

El "Pla de Diagnòstic i Tractament de la COVID-19 (Setena edició de l'assaig)" estipula clarament que un dels criteris perquè els pacients amb COVID-19 es guardin i donin l'alta de l'hospital és que dues mostres consecutives de les vies respiratòries tinguin una prova d'àcid nucleic negativa (almenys 24 hores d'entre elles), però hi ha molt pocs pacients amb el SARS-CoV-2.

(1) El SARS-CoV-2 és un virus nou.Cal entendre més el seu mecanisme patogènic, la imatge completa de la malaltia causada i les característiques del curs de la malaltia.Per tant, d'una banda, cal reforçar la gestió dels pacients donats d'alta i realitzar una observació mèdica de 14 dies.Fer un seguiment, vigilància de la salut i orientació sanitària per aprofundir en la comprensió de tot el procés d'aparició, desenvolupament i desenllaç de la malaltia.

(2) El pacient pot tornar a infectar-se amb el virus.L'acadèmic Zhong Nanshan va dir: Com que els pacients curats tenen anticossos, el SARS-CoV-2 es pot eliminar mitjançant anticossos quan tornen a envair-se.Hi ha moltes raons, que poden ser la causa del pacient recuperat, o poden estar relacionades amb la mutació del virus, o fins i tot la causa de les proves de laboratori.Si es tracta del virus en si, la mutació SARS-CoV-2 pot fer que l'anticossos produït pel pacient recuperat sigui ineficaç contra el virus mutat.Si el pacient torna a infectar-se amb el virus mutat, la prova d'àcid nucleic pot tornar a ser positiva.

(3) Pel que fa als mètodes de prova de laboratori, cada mètode de prova té les seves limitacions.La detecció d'àcids nucleics SARS-CoV-2 es deu a l'elecció de la seqüència del gen, la composició dels reactius, la sensibilitat del mètode i altres motius, fet que fa que els kits existents tinguin els seus propis límits de detecció inferiors.Després de tractar el pacient, el virus al cos disminueix.Quan la càrrega viral de la mostra a provar està per sota del límit inferior de detecció, apareixerà un resultat "negatiu".Tanmateix, aquest resultat no vol dir que el virus del cos hagi desaparegut completament.El virus pot ser després d'aturar el tractament.Ressorgiment”, segueix copiant.Per tant, es recomana revisar una vegada a la setmana dins de les 2 a 4 setmanes posteriors a l'alta.

(4) L'àcid nucleic és el material genètic del virus.El virus s'elimina després que el pacient hagi estat sotmès a tractament antiviral, però els fragments d'ARN viral restants encara es conserven al cos humà i no s'eliminen completament del cos.De vegades, en determinades circumstàncies, es pot mantenir més.Molt de temps, i en aquest moment la prova d'àcid nucleic serà positiva "transitòria".Amb l'allargament del temps de recuperació del pacient, després que els fragments d'ARN residuals del cos s'esgotin gradualment, el resultat de la prova d'àcid nucleic pot tornar negatiu.

(5) El resultat de la prova d'àcid nucleic del SARS-CoV-2 només demostra la presència o absència d'ARN viral i no pot demostrar l'activitat del virus i si el virus és transmissible.Cal demostrar si un pacient que torna a tenir una prova d'àcid nucleic positiva tornarà a ser una font d'infecció.Cal fer un cultiu de virus en mostres clíniques i cultivar un virus "viu" per demostrar que és infecciós.

Resum

En resum, els falsos negatius de la prova d'àcid nucleic SARS-CoV-2, els positius de reprovació i altres condicions que són incompatibles amb les manifestacions clíniques no es poden evitar completament.En el cribratge i les proves reals, es recomana combinar els símptomes clínics, els exàmens d'imatge (TC) i els resultats de les proves de laboratori (prova d'àcid nucleic + prova d'anticossos específics del virus) per a un diagnòstic complet per evitar diagnòstics perduts i errors.Si es troba que els resultats de la prova són òbviament inconsistents amb les manifestacions clíniques, es recomana dur a terme una anàlisi exhaustiva de tot l'enllaç de la prova (recollida de mostres, enllaços de circulació i processament) per excloure la possible infecció precoç del virus SARS-CoV-2, infecció recurrent o combinada amb altres infeccions per virus respiratoris, etc.Si les condicions ho permeten, es recomana recollir mostres més sensibles, com ara l'esput o el líquid de rentat alveolar per reexaminar-les.

Productes relacionats:

Kit de detecció d'àcids nucleics SARS-CoV-2 (mètode de sonda fluorescent PCR múltiple)